富H21溶液的輻射防護效應(yīng)及其機制研究.pdf

1、隨著科技的發(fā)展和社會的進步，電離輻射被廣泛用于醫(yī)用設(shè)備、研究機構(gòu)、核反應(yīng)堆及其輔助設(shè)施?，F(xiàn)在治療惡性腫瘤，放射治療是一種重要的治療方法。但放射治療殺傷腫瘤細胞的同時，也會對周圍的正常組織造成一定的損傷。而核電在使用過程中如操作不當，則會產(chǎn)生嚴重的核污染，如美國三里島核電站核泄漏、切爾諾貝利核事故、日本福島核事故等等。同時，核武器在現(xiàn)代戰(zhàn)爭中的使用也讓人們的生命受到了極大威脅，如科索沃戰(zhàn)爭中，美軍大量使用貧鈾彈，使急性放射病人大量出現(xiàn)，患

2、白血病的人數(shù)急劇上升。輻射對人類健康的威脅已經(jīng)越來越廣泛，目前被公認為是繼水、大氣、噪音污染之后的第四大污染。而加強電離輻射防護、防治各型放射病已成為當今急待解決的重要課題。
　　 腸上皮細胞是體內(nèi)增殖能力最快的組織之一，而胃腸道是輻射敏感器官之一，在輻射中很容易受到傷害。在胃腸道，小腸隱窩上皮細胞最容易受到輻射誘導(dǎo)細胞凋亡。腸型放射病病情發(fā)展迅速，病人常會發(fā)生惡心、腹瀉等癥狀，后果嚴重。在腸型放射病發(fā)病時，骨髓造血系統(tǒng)仍未發(fā)生

3、變化，輻射對患者主要損傷來自于腸道粘膜的壞死。心臟輻射后可造成慢性心臟泵血功能損傷和其他心臟疾病。最顯著的輻射誘導(dǎo)心臟疾病類型為心肌損害，該疾病由照射6-10周后毛細血管內(nèi)皮細胞的堿性磷酸酶活性缺失所致。同時，由于心肌細胞退化，血管周圍以及間質(zhì)可出現(xiàn)纖維化。目前，巰基化合物是最有效的輻射防護藥物。WR-2721可以有效的防護輻射對心臟的損害。但是其在使用過程中，副作用也十分明顯，病人會出現(xiàn)惡心、嘔吐、頭暈等反應(yīng)。在應(yīng)用WR-2721時，

4、仍需時刻注意其副作用的影響。所以，尋找一種安全、高效的輻射防護劑成為當前迫切的需要。
　　 電離輻射損傷機體的作用主要由輻射產(chǎn)生的羥自由基引起。Ohsawa等人發(fā)現(xiàn)，在生理學上，氫氣并不是人們常認為的惰性氣體，而具有選擇性抗氧化的作用。氫氣可以并且只與活性強和毒性強的活性氧反應(yīng)，比如·OH和ONOO-，而不與可以傳遞重要信號的活性氧反應(yīng)，是一種很好的抗氧化物質(zhì)。我教研室在2008年將富H2溶液首次用于細胞及小鼠的輻射防護，并且證

5、明了富H2溶液對細胞及小鼠具有很好的輻射防護作用。本課題試圖通過富H2溶液預(yù)處理減輕輻射造成的多個系統(tǒng)損傷、抑制細胞凋亡等來解釋富H2溶液的輻射防護效應(yīng)，從而為臨床應(yīng)用富H2溶液進行電離輻射防護、防治各型放射病提供實驗和理論依據(jù)。
　　 研究內(nèi)容:
　　 1.富H2培養(yǎng)液對人小腸上皮細胞的輻射防護作用:選取人正常小腸上皮細胞系HIEC作為研究對象，觀察以下指標:①γ射線輻射后HIEC細胞的存活率;②γ射線輻射后HIEC細

6、胞凋亡率的變化以及形態(tài)學改變;③γ射線輻射后HIEC細胞中DNA鏈斷裂的情況。
　　 2.富H2生理鹽水對γ射線輻射后Balb/c小鼠小腸的作用:①γ射線輻射后小腸中內(nèi)源性抗氧化劑的變化;②γ射線輻射后氧化損傷的變化;③γ射線輻射后小腸組織的病理改變;④γ射線輻射后小腸細胞的凋亡改變;⑤腹腔注射富H2生理鹽水后，小腸內(nèi)氫濃度的改變。
　　 3.富H2培養(yǎng)液對人正常臍靜脈內(nèi)皮細胞的輻射防護作用:選取人正常臍靜脈內(nèi)皮細胞系H

7、UVEC作為研究對象，觀察以下指標:①γ射線輻射后HUVEC細胞的存活率;②γ射線輻射后HUVEC的細胞凋亡率及形態(tài)學改變。
　　 4.富H2生理鹽水對γ射線輻射后Balb/c小鼠心臟的作用:①γ射線輻射后Balb/c小鼠的30天存活率;②γ射線輻射后心臟中內(nèi)源性抗氧化劑的變化;③γ射線輻射后心臟的氧化損傷變化;④γ射線輻射后心臟組織的病理改變;⑤γ射線輻射后心肌纖維化的改變;⑥γ射線輻射后心肌細胞DNA鏈的斷裂情況。
　

8、　 5.富H2溶液輻射防護作用的機制研究:①利用HPF探針，觀察富H2溶液清除HIEC細胞內(nèi)輻射所致·OH的效果;②富H2溶液對輻射后小鼠小腸caspase-3活性的影響;③富H2溶液對照后細胞中凋亡相關(guān)蛋白表達的影響;④富H2溶液對照后細胞中基因表達的影響。
　　 6.富氫溶液對輻射后人正常臍靜脈內(nèi)皮細胞基因表達譜的影響。
　　 實驗方法:
　　 1.富H2生理鹽水或富H2培養(yǎng)液的制備:將生理鹽水或培養(yǎng)液置入

9、密封袋中，充入足量氫氣后加壓。富H2培養(yǎng)液保存于4度冰箱，每周更換一次，保證氫氣濃度為0.6mmol/L。
　　 2.細胞培養(yǎng):HIEC細胞、HUVEC細胞使用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，加1％雙抗，置于含5％ CO2的37℃細胞培養(yǎng)箱中。隔天細胞傳代。
　　 3.細胞及小鼠輻射模型建立:γ射線，1.0Gy/min。
　　 4.輻射產(chǎn)生的羥自由基的消除:使用HPF探針，在熒光顯微鏡下觀察熒光強度進行分析。<

10、br>　　 5.輻射后檢測細胞生存率:輻射后使用CCK-8試劑盒檢測以及輻射后結(jié)晶紫染色檢測細胞克隆。使用Hoechst/PI熒光染色法檢測細胞核形態(tài)、細胞存活率以及細胞死亡率。
　　 6.細胞凋亡率檢測:Annexin V/PI染色后，使用流式細胞儀檢測。
　　 7.細胞DNA損傷檢測:單細胞凝膠電泳分析檢測DNA斷裂。
　　 8.小腸內(nèi)氫氣濃度的檢測:小鼠腹腔注射富H2生理鹽水。使用氫濃度檢測儀檢測不同時間

11、點小鼠體內(nèi)氫氣濃度變化。
　　 9.氧化相關(guān)指標的測定:使用超氧化物歧化酶SOD、谷胱甘肽GSH、丙二醛MDA、羰基化蛋白PC及8羥基脫氧鳥苷8-OHdG試劑盒檢測。
　　 10.小鼠小腸心臟組織結(jié)構(gòu)的變化:利用HE染色切片觀察病理變化。
　　 11.小鼠小腸細胞的凋亡檢測:使用TUNEL染色試劑盒檢測。
　　 12.凋亡相關(guān)蛋白的檢測:Western blot檢測γ射線照射后人小腸上皮細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白

12、的表達情況。
　　 13.γ射線照射后基因表達的影響:Real-time PCR檢測γ射線照射后人臍靜脈內(nèi)皮細胞內(nèi)基因表達情況。
　　 14.富氫溶液對輻射后人正常臍靜脈內(nèi)皮細胞基因表達譜的影響:使用Affymetrix基因芯片檢測，使用Real-time PCR方法進行芯片結(jié)果驗證。
　　 15.統(tǒng)計學分析:兩組比較，非單組間的比較，采用t檢驗。多組間比較，采用方差分析。方差分析p＜0.05時，進行組間兩兩比較

13、，使用SNK-P法。P＜0.05時認為各組間差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 實驗結(jié)果:
　　 1.富H2培養(yǎng)液預(yù)處理減輕輻射后人小腸上皮細胞損傷:
　　 經(jīng)各劑量γ射線輻射后，與照射對照組的HIEC細胞相比富H2培養(yǎng)液可以顯著提高照射后HIEC細胞的存活率和克隆形成率。12Gy1Gy/min(Y)射線照射后24小時流式細胞儀檢測細胞的凋亡率，對照組細胞的凋亡率為50.7％，給予富H2培養(yǎng)液預(yù)處理組細胞的凋亡率為39.

14、3％(P＜0.01)。經(jīng)過富H2溶液預(yù)處理的HIEC細胞，其彗星尾的長度較照射對照組彗星尾的長度明顯減少，對受照HIEC細胞DNA的損傷具有較好的防護作用。以上結(jié)果提示富H2培養(yǎng)液對HIEC細胞具有很好的輻射防護作用。
　　 2.富H2生理鹽水預(yù)處理減輕輻射后小鼠小腸的損傷:
　　 4、8Gyγ射線照后檢測小鼠小腸組織中的SOD和GSH含量，富H2生理鹽水組小鼠外周血SOD、GSH活性顯著高于照射對照組，同時富H2生理鹽

15、水可顯著降低輻射后小鼠小腸組織中的MDA、8-OHdG和PC的濃度。HE染色小鼠小腸組織，Chiu評分統(tǒng)計顯示富H2生理鹽水處理可顯著減少輻射引起的小腸粘膜損傷。通過TUNEL染色法觀察小鼠小腸細胞的凋亡情況，4Gy正常生理鹽水組的細胞TUNEL陽性率為46.75％，而富H2生理鹽水組的TUNEL細胞陽性率為24.5％。8Gy正常生理鹽水組的細胞TUNEL陽性率為67％，而富H2生理鹽水組的TUNEL陽性率為36％，4Gy組和8Gy組富

16、H2生理鹽水組和正常生理鹽水組TUNEL陽性細胞率差異相比具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。說明富H2生理鹽水能夠減輕輻射引起小腸細胞凋亡。
　　 3.富H2培養(yǎng)液預(yù)處理減輕輻射后人正常臍靜脈內(nèi)皮細胞的損傷:
　　 HUVEC細胞不同劑量照射后，與照射對照組細胞相比富H2培養(yǎng)液可以顯著提高照射后HUVEC細胞的存活率和克隆形成率。4Gy(Y)線照射后培養(yǎng)24小時，收集細胞后用Annexin V/PI染色，正常培養(yǎng)液對照組的

17、凋亡率為32.2％，富H2溶液組凋亡率為14.7％，兩組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。使用Hoechst33342/PI雙染可見，照射對照組HUVEC細胞在照后藍色熒光增強，亮紅色細胞增多，而富H2培養(yǎng)液預(yù)處理后強藍色熒光和亮紅色細胞比照射對照組降低，可以減少HUVEC細胞的凋亡和死亡。
　　 4.富H2生理鹽水預(yù)處理減輕輻射后小鼠心臟的損傷:
　　 給予7Gy照射后，檢測小鼠30天生存率，每組小鼠20只，13

18、天時，對照組90％的小鼠死亡，而富H2組仍有80％的小鼠存活，提示富H2生理鹽水及富H2水對小鼠有輻射防護作用。6Gy照后4h檢測小鼠心臟組織中的SOD和GSH含量，富H2生理鹽水組小鼠心臟中SOD、GSH活性顯著高于照射對照組，同時腹腔注射富H2生理鹽水可以顯著降低輻射后小鼠心臟組織中的MDA和8-OHdG的濃度。通過HE染色法來觀察小鼠心臟輻射后1天及100天的病理變化。1天后，對照組和富H2生理鹽水組均無明顯改變，100天后，對照

19、組心肌退化明顯，有空泡形成，而富H2生理鹽水組沒有明顯的病理改變。照射后100天，取小鼠心臟，通過MASSON染色法觀察小鼠心肌細胞纖維化的情況，生理鹽水對照組MASSON染色陽性細胞率為5％，而富H2生理鹽水組的MASSON陽性細胞率為3.1％。富H2生理鹽水組和生理鹽水對照組差異相比具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。以上結(jié)果說明富H2生理鹽水能夠減輕輻射引起的心臟損傷和心肌細胞纖維化的形成。
　　 5.富H2溶液輻射防護作用的

20、機制探討
　　 5.1富H2培養(yǎng)液對輻射產(chǎn)生羥自由基的清除作用:經(jīng)12Gy射線輻射后，使用HPF染色，熒光顯微鏡觀察熒光強度變化，發(fā)現(xiàn)富H2培養(yǎng)液組中的熒光強度明顯低于照射對照組，說明富H2溶液對輻射產(chǎn)生的羥自由基具有較強的清除作用。
　　 5.2富H2生理鹽水對受照小鼠小腸內(nèi)Caspase3活性的影響:小鼠經(jīng)6Gyγ射線照后各時間點取小腸組織，檢測結(jié)果顯示各個時間點富H2溶液組小鼠小腸內(nèi)caspase3活性較對照組有明

21、顯下降(P＜0.01)。表明富H2生理鹽水可以減輕輻射所導(dǎo)致的凋亡發(fā)生，減輕輻射引起的小腸損傷。
　　 5.3富H2培養(yǎng)液預(yù)處理對輻射后人小腸上皮細胞中凋亡相關(guān)蛋白的作用:12Gyγ射線輻射24h后，提取HIEC細胞的蛋白進行Western blot檢測。結(jié)果顯示富H2培養(yǎng)液組中Bcl-2的表達明顯上調(diào)，Bax的表達顯著下調(diào)。
　　 5.4富H2溶液對受照人臍靜脈內(nèi)皮細胞內(nèi)基因表達的影響:HUVEC細胞在經(jīng)過4Gyγ射線

22、照射4h后，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后進行Real-time PCR檢測。結(jié)果顯示，富H2組中的Bcl-2的產(chǎn)生明顯上升，而Bax的產(chǎn)生明顯減少。
　　 6.基因表達譜檢測:
　　 分析基因表達譜結(jié)果，提示富氫溶液可以調(diào)控細胞周期，減少細胞凋亡及死亡，減輕炎癥反應(yīng)，增加細胞抵抗力，提高細胞增值能力，改善機體物質(zhì)代謝，提高營養(yǎng)利用率，加強生物合成效應(yīng)，促進細胞因子-細胞因子受體的相互作用。
　　 討論與分析:
　　

23、 電離輻射會對機體造成嚴重的損傷，其對機體產(chǎn)生的作用分為兩種，一種為直接作用，造成DNA的斷裂，另一種為間接作用，可產(chǎn)生大量的羥自由基，進一步造成組織細胞的脂質(zhì)過氧化、氧化DNA損傷和蛋白質(zhì)羰基化，最終導(dǎo)致細胞凋亡和死亡。2007年Ohsawa等人發(fā)現(xiàn)，氫氣是一種非常理想的抗氧化物質(zhì)，其具有選擇性抗氧化的作用。氫氣可以并且只與活性強和毒性強的活性氧反應(yīng)，比如·OH和ONOO-，而不與可以傳遞重要信號的活性氧反應(yīng)。本實驗室也在之前的研究

24、中證明了富H2溶液具有良好的輻射防護作用，我們在對HIEC和HUVEC細胞的實驗中發(fā)現(xiàn)，富H2培養(yǎng)液預(yù)處理可以增加輻射后上述細胞的存活率，增強細胞的增殖力，減少細胞的凋亡水平。應(yīng)用富H2生理鹽水預(yù)處理后，小鼠的生存率明顯提高，并可以提高機體的抗氧化能力，減輕小鼠小腸上皮損傷及小腸上皮細胞凋亡，減少輻射引起的心臟損傷，并且抑制輻射后心肌細胞纖維化的形成。經(jīng)以上研究，我們發(fā)現(xiàn)在使用Y線照射之前應(yīng)用富H2溶液，可以有效的清除輻射時產(chǎn)生的羥自由

25、基，防止了脂質(zhì)過氧化、蛋白過氧化和DNA過氧化，并且可以調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達，最后抑制細胞的死亡與凋亡。在應(yīng)用基因表達譜檢測后，我們進一步發(fā)現(xiàn)氫氣可以減少細胞凋亡以及程序性死亡，抑制補體級聯(lián)反應(yīng)，減輕炎癥，增強氨基酸羧酸的轉(zhuǎn)運，加強細胞對低氧環(huán)境抵抗力，提高對細胞外刺激的應(yīng)答，調(diào)節(jié)細胞周期等。
　　 結(jié)論:
　　 富H2溶液對人小腸上皮細胞、人臍靜脈內(nèi)皮細胞及小鼠小腸和心臟具有良好的輻射防護作用，其作用機制與有效清除輻