促孕復(fù)方促著床活性成分及作用機(jī)制的研究.pdf

1、以體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transplantation,IVF-ET)為中心的輔助生殖技術(shù)近年來(lái)迅速發(fā)展,在臨床得到了廣泛的應(yīng)用。然而ET胚胎著床障礙依然是限制此項(xiàng)技術(shù)發(fā)展的瓶頸。因此尋找提高超排卵(controlled ovarian stimulation,COS)后胚胎著床率的藥物以及對(duì)著床機(jī)制的探討成為生殖領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題。本研究運(yùn)用COS著床障礙動(dòng)物模型篩選促孕復(fù)方促著床

2、活性物質(zhì),對(duì)活性成分作用機(jī)制進(jìn)行分析研究,同時(shí)對(duì)活性成分DS147進(jìn)行初步質(zhì)量控制研究。
　　一、促孕復(fù)方促進(jìn)胚胎著床活性物質(zhì)篩選
　　對(duì)促孕復(fù)方進(jìn)行梯度極性系統(tǒng)的萃取和柱層析分離,運(yùn)用COS著床障礙動(dòng)物模型篩選促著床活性成分。將受孕小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和給藥組,采用COS誘導(dǎo)小鼠胚泡著床障礙,給予促孕復(fù)方不同極性部位及部位活性成分進(jìn)行干預(yù),于妊娠第8天(PD8)處死小鼠,觀察妊娠率及平均著床點(diǎn)數(shù)。結(jié)果顯示促孕復(fù)方乙酸

3、乙酯部位可將著床障礙小鼠妊娠率提高至50％(P<0.05),乙酸乙酯部位活性成分DS147可將著床障礙小鼠妊娠率提高至83.3%(P<0.01),且未發(fā)現(xiàn)對(duì)正常妊娠有不良影響。促孕復(fù)方有效部位活性成分DS147能更顯著地提高超排卵后的妊娠率,促進(jìn)著床障礙小鼠胚胎著床。
　　二、促孕復(fù)方活性成分DS147促著床機(jī)制研究
　　采用COS誘導(dǎo)小鼠胚泡著床障礙,給予有效部位活性成分DS147進(jìn)行干預(yù),于PD5天處死小鼠。從黃體發(fā)育,

4、子宮內(nèi)膜蛻膜化,基質(zhì)降解,血管滲透性,血管生成以及胎盤發(fā)育等方面來(lái)探討DS147促著胚胎著床的機(jī)制。結(jié)果表明該活性物質(zhì)的促著床作用與提高基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix matalloproteinases,MMP-2)表達(dá),抑制金屬蛋白酶組織抑制物(tissue in-hibitor of metalloproteinases,TIMP-2)表達(dá)從而促進(jìn)基質(zhì)降解,促進(jìn)血管生成相關(guān)因子CD34,血管生成素(angiogenin,ANG)表

5、達(dá)促進(jìn)血管生成,改善卵巢黃體溶解,促進(jìn)子宮內(nèi)膜蛻膜化以及胎盤發(fā)育密切相關(guān)。DS147能顯著改善超排卵后受損傷的子宮內(nèi)膜及卵巢發(fā)育,提高妊娠率。
　　三、促孕復(fù)方活性成分DS147有關(guān)物質(zhì)含量測(cè)定和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究
　　建立促孕復(fù)方DS147中總黃酮,總皂苷,總多糖的紫外含量測(cè)定方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)?？傸S酮的含量采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法在505nm波長(zhǎng)處測(cè)定,總皂苷采用5%香草醛冰醋酸-高氯酸比色法在540nm波長(zhǎng)處測(cè)定,總

6、多糖采用苯酚-濃硫酸比色法在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定。采用薄層色譜法(TLC)對(duì)活性成分DS147中黃芪,黃芩,續(xù)斷進(jìn)行定性鑒別;用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法(HPLC-ELSD)測(cè)定黃芪甲苷的含量。結(jié)果表明促孕復(fù)方DS147中總黃酮、總皂苷、總多糖的含量分別為33.78%,40.42%和9.36%;相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為1.36%,2.35%,0.69%。黃芪甲苷的含量為0.331%,RSD=1.01%。紫外含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確,可