促腸道PEPT1作用藥用輔料的篩選及機制研究.pdf

1、目的：寡肽轉運蛋白1（peptide transporter1，PEPT1）是一種主要表達于小腸上皮細胞刷狀緣膜側、以氫離子濃度梯度差為動力的主動轉運蛋白，其底物非常廣泛，可介導二肽、三肽以及類肽藥物的口服吸收。PEPT1屬于高容量、低親和力的轉運蛋白，因此其對大部分底物藥物的轉運效率有限，導致藥物口服生物利用度較低。目前專屬的PEPT1轉運功能促進劑未見文獻報道，無藥理活性、低毒且具有較強促PEPT1轉運功能的物質的研究可能是提高PE

2、PT1底物藥物口服吸收的新思路。本實驗室在前期研究過程中發(fā)現(xiàn)某些藥用輔料對PEPT1底物藥物有一定的促吸收作用，據(jù)此，本文以常用藥用輔料為研究對象，考察所選輔料對PEPT1轉運功能的影響，利用分子生物學技術探討活性藥用輔料促吸收機制，并通過整體動物模型對其促PEPT1作用進一步驗證和研究，希望篩選出具有較強PEPT1促進作用的輔料。
　　方法：本課題采用Caco-2細胞模型，以MTT法考察了22種常用藥用輔料對細胞活性的影響，確定

3、細胞攝取試驗中輔料的濃度梯度；進而以PEPT1經(jīng)典底物Gly-Sar為探針藥物，利用HPLC-MS/MS法測定藥物在細胞破碎液中的含量，計算細胞攝取率（Uptake ratio，UR）評價藥用輔料對Caco-2細胞膜上PEPT1功能的影響。通過Western blot以及熒光實時定量PCR測定活性藥用輔料對Caco-2細胞中PEPT1蛋白表達量以及mRNA表達量的影響。運用熒光探針從胞內pH以及膜流動性兩個方面考察了活性輔料對Caco-

4、2細胞中PEPT1影響的作用機制。為了進一步驗證篩選出的活性藥用輔料對PEPT1底物藥物口服吸收的影響，本文采用福辛普利鈉為探針藥物，用HPLC-MS/MS法同時測定大鼠體內原藥以及活性代謝物福辛普利拉的濃度，考察RH40、EL35、PEG400、吐溫20以及吐溫80對PEPT1轉運功能的影響，并采用蛋白印跡法測定大鼠小腸各段PEPT1蛋白表達水平的變化。
　　結果：細胞攝取試驗結果表明加入EL35、RH40、PEG400、PEG

5、6000、Eudragit L100、Eudragit L100-55、Eudragit RL PO、HPMC E30、吐溫20、吐溫80、CMC-Na、CMS-Na以及殼聚糖，可顯著影響Gly-Sar的細胞攝取量，推測這些輔料對PEPT1的功能有著不可忽視的作用。其余9種輔料（泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、PEG800、PEG1500、PEG4000、PVP K30、環(huán)糊精、Transcutol P、微晶纖維素）對探針二肽的攝取量無

6、顯著性影響。Western blot結果表明PEG400、CMS-Na、EL35、RH40、吐溫20、吐溫80、Eudragit L100以及Eudragit L100-55均可增加PEPT1膜蛋白的含量，而活性藥用輔料并不能顯著誘導或抑制PEPT1基因的表達，推測蛋白水平的增加主要是由于胞質內的PEPT1向細胞膜上轉移和嵌入的結果。部分活性藥用輔料可在一定程度上降低胞內pH值，影響程度依次為吐溫20＞EL35>吐溫80> PEG400

7、≈ RH40。此外，PEG6000、殼聚糖、CMS-Na以及Eudragit L100可以減低孵育液的pH值，推測細胞內外的氫離子濃度梯度差增加可能是上述9種輔料促進PEPT1底物藥物攝取的原因之一。膜流動性結果表明PEG400、EL35、RH40、吐溫20、吐溫80均可增加Caco-2細胞的膜流動性。因此，輔料PEG400、EL35、RH40、吐溫20、吐溫80的顯著促PEPT1轉運作用與細胞膜上蛋白含量增加、細胞內外氫離子濃度梯度增

8、大以及細胞膜流動性增加相關。大鼠藥動學試驗結果顯示，PEG400、RH40、EL35、吐溫20及吐溫80各個輔料組福辛普利鈉的相對生物利用度分別為90.98％、725.27%、190.65%、240.00%和156.17%，代謝物福辛普利拉的相對生物利用度分別為171.25%、207.33%、253.33%、253.76%、200.05%。灌胃給予上述5種活性輔料24h后，各個輔料對大鼠十二指腸PEPT1蛋白表達豐度沒有顯著影響，對空腸

9、和回腸PEPT1蛋白表達均表現(xiàn)出一定的下調作用，提示上述輔料確實可以通過影響腸道PEPT1轉運功能促進底物藥物的吸收。
　　結論：綜上所述，本文通過考察22種藥用輔料在Caco-2細胞模型中促進PEPT1轉運的作用，篩選出14種輔料進一步進行PEPT1促吸收作用機制研究，最后在整體動物水平選取5種具有顯著促進PEPT1作用的活性藥用輔料驗證了其對底物的吸收促進作用。研究結果顯示RH40、EL35等多種輔料均具有促進PEPT1轉運作