藥用輔料抑制腸道P-糖蛋白藥泵作用研究.pdf

1、P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）是一種170kDa大小的ATP能量依賴型的外排蛋白，即“藥物溢出泵”，能將吸收進入漿膜側(cè)的藥物重新泵回粘膜側(cè)，導(dǎo)致藥物吸收減少，生物利用度降低。抑制P-糖蛋白的藥物溢出泵作用可有效地提高某些口服藥物的吸收率，降低肝、腎清除率。許多早期的外排泵抑制劑如維拉帕米、普羅帕酮等，會產(chǎn)生一些不可接受的毒副作用，而限制其臨床應(yīng)用。因此，尋找一些無毒、無藥理活性的逆轉(zhuǎn)劑成為國內(nèi)外藥劑學(xué)者關(guān)注的新焦點

2、。本論文以藥用輔料為研究對象，選用塞利洛爾為P-gp探針?biāo)幬?，采用Caco-2細胞單層膜模型、離體小腸外翻模型、在體小腸灌流模型與原位小腸吸收模型考察P-gp藥泵作用在塞利洛爾跨膜轉(zhuǎn)運與透膜吸收中發(fā)揮的作用，比較不同藥用輔料種類及不同濃度對P-gp藥泵作用的抑制強度，希望篩選出具有較強P-gp抑制作用的輔料。 Caco-2細胞模型已經(jīng)作為一種簡便、高效的體外模型廣泛應(yīng)用于口服藥物吸收機制及候選藥物的高通量篩選。本實驗采用Caco

3、-2細胞模型，利用測定跨膜電阻值和酚紅透過試驗檢驗其完整性。完整性檢測合格后可用于探針?biāo)幬锶鍫柨缒まD(zhuǎn)運實驗，以維拉帕米為陽性對照，利用HPLC法測定藥物跨膜轉(zhuǎn)運量，計算跨膜轉(zhuǎn)運參數(shù)表觀滲透系數(shù)Papp與外排率ER值來評價藥用輔料對Caco-2細胞膜上P-gp外排功能的抑制作用。塞利洛爾在Caco-2細胞單層膜AP→BL方向的Papp值遠小于BL→AP方向的Papp值，陽性P-gp逆轉(zhuǎn)劑維拉帕米使塞利洛爾AP→BL方向跨膜轉(zhuǎn)運的Pap

4、p值增加30％，BL→AP方向的Papp值降低50％，說明P-gp在塞利洛爾跨膜轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮重要作用。輔料F-68，Cremophor EL，Cremophor RH40，T-80，PEG200，PEG400，PEG4000，β-CD，HP-β-CD，PVP K30，TritonX 100，S-40可增加塞利洛爾AP→BL方向跨膜轉(zhuǎn)運的Papp值并降低BL→AP方向的Papp值；T-20，T-60，PEG1000，PEG2000，PE

5、G6000，PVP K10隨濃度的提高可增加塞利洛爾AP→BL方向跨膜轉(zhuǎn)運的Papp值并降低BL→AP方向的Papp值；Lecithin對塞利洛爾AP→BL方向跨膜轉(zhuǎn)運的Papp值與BL→AP方向的Papp值均無明顯影響；SDS具有較大的細胞毒性使塞利洛爾AP→BL方向跨膜轉(zhuǎn)運的Papp值與BL→AP方向的Papp增加異常。進一步通過外排率ER值評價輔料抑制P-gp作用強度，結(jié)果表明F-68、Cremophor EL、Cremophor

6、 RH40、T-20、T-60、T-80、PEG200、PEG400、β-CD、HP-β-CD、S-40等可顯著抑制塞利洛爾細胞膜外排方向轉(zhuǎn)運，在Caco-2細胞模型中具有明顯抑制P-gp藥泵作用。 大鼠離體外翻小腸吸收與外排模型分別選擇大鼠小腸空腸段與結(jié)腸段進行研究。以維拉帕米作陽性對照，考察F-68、Cremophor EL、Cremophor RH40、T-60、T-80、PEG200、PEG400、PEG1000、HP-

7、β-CD、S-40十種藥用輔料對塞利洛爾從外翻小腸囊的粘膜層向漿膜層（M→S）、漿膜層向粘膜層（S→M）轉(zhuǎn)運情況，評價低中高輔料濃度逆轉(zhuǎn)小腸P-gp藥泵作用對塞利洛爾促吸收與抑制外排作用。離體外翻小腸吸收模型實驗結(jié)果表明F-68、Cremophor RH40、PEG400、T-80具有較強的促吸收作用；Cremophor EL、T-60、PEG200、PEG1000、S-40隨濃度提高促吸收作用增強；HP-β-CD對藥物M→S吸收影響不

8、大。離體外翻小腸外排模型實驗結(jié)果表明F-68、Cremophor EL、Cremophor RH40、T-60、T-80、PEG200、PEG400、S-40具有較強的抑制外排作用；PEG1000與HP-β-CD隨濃度提高抑制外排作用增強。 大鼠在體小腸灌流模型不僅用于評價藥物及其制劑口服吸收情況，還廣泛應(yīng)用于生物膜的轉(zhuǎn)運機制研究。本文選用該模型研究F-68、Cremophor EL等10種藥用輔料對在體小腸灌流后塞利洛爾吸收的

9、影響。結(jié)果表明F-68、Cremophor EL、Cremophor RH40、T-60、T-80、PEG200、PEG400、S-40可顯著提高藥物吸收速率常數(shù)ka與有效透過系數(shù)Peff，由于塞利洛爾為P-gp典型底物，因此推斷藥物促吸收作用與抑制P-gp外排作用密切相關(guān)；但輔料PEG1000與HP-β-CD對塞利洛爾在體腸灌流吸收無明顯促進作用。 在Caco-2細胞模型、離體與在體動物模型研究基礎(chǔ)上，進一步采用整體動物模型原

10、位小腸吸收實驗考察F-68、Cremophor EL等10種藥用輔料對塞利洛爾十二指腸處給藥后透膜吸收的影響。采用HPLC法測定血藥濃度，DAS軟件計算藥代動力學(xué)參數(shù)，評價藥用輔料對P-gp抑制作用及促進塞利洛爾吸收的影響。從藥時曲線結(jié)果分析，給予F-68、Cremophor EL、Cremophor RH40、T-80、PEG200、PEG400、S-40后塞利洛爾血藥濃度均有不同程度的提高，但給予輔料T-60、PEG1000、HP-

11、β-CD后塞利洛爾藥時曲線與陰性對照組相當(dāng)，遠低于維拉帕米陽性對照組水平。從藥代動力學(xué)參數(shù)分析，給予藥用輔料后藥物半衰期t1/2有所延長，清除率CL降低。同時藥時曲線下面積AUC統(tǒng)計分析結(jié)果表明：F-68、Cremophor RH40、PEG200、PEG400、S-40高濃度組與Cremophor EL、T-80中高濃度組可明顯提高塞利洛爾藥時曲線下面積AUC，從而促進藥物吸收；同時上述各輔料其它濃度組均可在一定程度上提高藥物AUC，

12、但統(tǒng)計學(xué)分析無顯著性差異。輔料T-60、PEG 1000與HP-β-CD在整體動物模型中對塞利洛爾各參數(shù)幾乎無影響，提示上述三種輔料不影響藥物吸收過程。 選擇四種具有抑制P-gp藥泵作用的輔料逆轉(zhuǎn)劑F-68、Cremophor EL、T-80、PEG400考察其對大鼠小腸P-gp表達的影響，分別采用BCA蛋白濃度測定試劑盒、運用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳與凝膠圖像分析技術(shù)、免疫印跡技術(shù)分析逆轉(zhuǎn)劑與P-gp表達之間的關(guān)系。單獨給予

13、藥物塞利洛爾或聯(lián)合給予塞利洛爾與輔料逆轉(zhuǎn)劑均可促進P-gp表達，但發(fā)現(xiàn)輔料逆轉(zhuǎn)劑與維拉帕米可明顯誘導(dǎo)外排蛋白的進一步表達。 選取更昔洛韋作為實驗藥物，考察輔料逆轉(zhuǎn)劑F-68、Cremophor EL、T-80、PEG400對更昔洛韋在Caco-2細胞模型及原位小腸吸收實驗?zāi)Ｐ椭锌缒まD(zhuǎn)運與透膜吸收情況，評價輔料逆轉(zhuǎn)劑抑制P-gp作用對提高更昔洛韋口服吸收的影響。在Caco-2細胞模型中維拉帕米與輔料逆轉(zhuǎn)劑可提高更昔洛韋AP→BL方

14、向表觀滲透系數(shù)Papp，降低BL→AP方向的表觀滲透系數(shù)Papp，從而使外排率ER值明顯下降，統(tǒng)計分析結(jié)果表明：維拉帕米組及輔料逆轉(zhuǎn)劑各中高濃度組的外排率ER值與陰性對照組間有顯著性差異，輔料逆轉(zhuǎn)劑其它濃度組也均使更昔洛韋外排率降低，但無統(tǒng)計學(xué)意義。在原位小腸吸收實驗中給予輔料逆轉(zhuǎn)劑F-68、Cremophor EL、T-80、PEG400后更昔洛韋血藥濃度均有一定程度的提高，其中Cremophor EL低中濃度組、T-80低濃度組、P

15、EG400低濃度組對藥時曲線下面積有顯著性影響，其它高濃度組無明顯影響。 本文通過考察20種藥用輔料在Caco-2細胞模型中抑制P-gp外排作用，篩選出10種輔料進一步進行離體、在體、整體動物實驗?zāi)Ｐ秃Y選，并考察具有較強P-gp抑制作用的輔料逆轉(zhuǎn)劑對腸道P-gp蛋白表達影響，結(jié)果表明非離子表面活性劑等藥用輔料具有抑制P-gp藥泵外排功能，減少藥物外排量，能促進塞利洛爾與更昔洛韋腸道吸收，可提高底物藥物口服生物利用度。但輔料逆轉(zhuǎn)劑

16、在抑制P-gp藥泵外排功能的同時可促進其蛋白表達。從作用機制角度分析，藥物吸收提高的同時蛋白表達量增加，提示抑制P-gp藥泵作用機制不是通過抑制蛋白表達而可能通過其它途徑如抑制ATP酶活性、競爭性結(jié)合位點、P-gp構(gòu)象改變等實現(xiàn)的。 輔料逆轉(zhuǎn)劑具有毒性低，刺激性小，生物相容性好等特點，可用于水溶性、脂溶性、甚至一些難溶性藥物的載體，在藥劑學(xué)領(lǐng)域?qū)懈鼜V泛的應(yīng)用。此外，通過抑制P-gp的外排功能，一些藥用輔料具有逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞多藥