Pluronic膠束給藥系統(tǒng)的構(gòu)建及與腸道P-糖蛋白藥泵作用研究.pdf

1、影響口服給藥吸收的三個主要因素是溶出率、溶解度及通透性。疏水性藥物的溶出通常是其吸收的限速階段，因此，提高疏水性藥物的溶解度和溶出速度可解決此類藥物低口服吸收的難題，但是即使這樣促吸收作用也不一定十分明顯。近年來大量研究已發(fā)現(xiàn)，腸上皮細(xì)胞膜上的P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）藥泵作用和細(xì)胞色素P450（CYP）藥物代謝酶系統(tǒng)對口服藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和藥物的生物利用度可產(chǎn)生重大影響。P-gp可能量依賴性地將吸收的藥物重新泵

2、回腸腔中去，P-gp的這一作用又稱為“藥物溢出泵”（drug efflux pump），是限制P-gp底物藥物吸收的主要因素，也是藥物口服吸收的重要屏障。近年來不斷有研究報道一些在在制劑中常常使用的普通輔料同樣具有P-gp的抑制作用，這些輔料的優(yōu)勢是安全、不會被胃腸道吸收，以往常常被當(dāng)作增溶劑或穩(wěn)定劑使用。這些發(fā)現(xiàn)對克服P-gp藥泵作用，提高口服藥物生物利用度提供了美好的前景。但是在研究過程中也發(fā)現(xiàn)，許多具有P-gp藥泵抑制作用的藥用輔

3、料雖然在體外得到理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但在整體動物實(shí)驗(yàn)中抑制作用往往減弱甚至消失。原因可能是復(fù)雜的胃腸道生理因素（介質(zhì)的稀釋、腸上皮細(xì)胞膜的通透性、內(nèi)容物阻滯等）使藥用輔料未能有效地接觸或進(jìn)入腸上皮細(xì)胞發(fā)揮抑制P-gp的功能。因此，增加具有陽性抑制作用的藥用輔料與腸上皮細(xì)胞有效的接觸和滲入，提高輔料在腸壁細(xì)胞內(nèi)的濃度，更好地發(fā)揮“藥泵”抑制作用以增加藥物的透過率，可能是突破P-gp底物藥物吸收瓶頸的重要手段。隨著一些新的給藥系統(tǒng)的快速發(fā)展，越

4、來越多的研究證明，脂質(zhì)體，微球，聚合物膠束、納米粒等藥物給藥系統(tǒng)都可以有效的提高藥物治療作用，同時降低藥物的副作用，而且組成這些納米給藥系統(tǒng)的載體材料很多本身已經(jīng)被證明也有抑制P-gp藥泵的作用。因此將兩者聯(lián)合使用來是否可以更好的促進(jìn)P-gp底物藥物吸收，改善藥物的有效治療已逐漸引起人們的注意。
　　 本文首先以P-gp底物-R-123為熒光探針，Pluronic聚合物為研究對象，采用Caco-2細(xì)胞模型和外翻腸囊模型篩選出對腸

5、道P-gp藥泵具有抑制作用的載體材料；繼而考察其抑制P-gp的作用機(jī)制及載體材料膠束化前后對R-123在Caco-2細(xì)胞跨膜機(jī)制的影響；然后以伊曲康唑?yàn)槟Ｐ退幬?，以抑制P-gp作用最強(qiáng)的P123為主要載體材料構(gòu)建了伊曲康唑膠束給藥系統(tǒng)，通過大鼠小腸單向灌流法和體內(nèi)法驗(yàn)證膠束給藥系統(tǒng)提高生物利用度的可能性，進(jìn)一步探討膠束給藥系統(tǒng)促進(jìn)藥物吸收與P-gp藥泵的關(guān)聯(lián)。本實(shí)驗(yàn)采用MTT法，首先考察了Pluronic載體材料對Caco-2細(xì)胞的毒性

6、作用。結(jié)果表明，除L61外，Pluronic F127，F(xiàn)68，P123和P85載體材料在實(shí)驗(yàn)濃度（0.0001％～5％）范圍內(nèi)細(xì)胞毒性較小，對細(xì)胞的生長基本沒有影響。采用Caco-2細(xì)胞模型，進(jìn)行細(xì)胞攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)，以維拉帕米為陽性對照，利用HPLC法測定并計算R-123的細(xì)胞攝取量、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)參數(shù)表觀滲透系數(shù)Papp與外排率ER值，來評價Pluronic載體材料對Caco-2細(xì)胞膜上P-gp外排功能的抑制作用。細(xì)胞攝取試驗(yàn)表明 F12

7、7，F(xiàn)68，P85和P123對R-123的細(xì)胞攝取具有不同程度的促進(jìn)作用，但是具有濃度依賴性，在接近或超過臨界膠束濃度（CMC）后，細(xì)胞攝取達(dá)到最大值，然后隨著Pluronic濃度的繼續(xù)增大，促進(jìn)作用反而逐漸減弱，提示其對P-gp藥泵具有一定的抑制作用。細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)結(jié)果表明P123在膠束化前后（濃度分別為0.001％、1％）均可明顯降低R-123的Papp（(BL→AP)值(P<0.05)，顯著降低ER(P<0.05)，與維拉帕米組的E

8、R值無顯著差別，提示其抑制P-gp作用強(qiáng)度與維拉帕米相當(dāng)。而F127、F68和P85組，高濃度（1％）組均可明顯降低R-123的Papp（(BL→AP)值(P<0.05)，顯著降低ER(P<0.05)，而低濃度組（0.001％）對R-123的轉(zhuǎn)運(yùn)無顯著影響，這與藥物攝取試驗(yàn)結(jié)果相一致，進(jìn)一步驗(yàn)證Pluronic系列載體材料對P-gp的抑制作用，
　　 本研究采用外翻腸囊法考察了P123和F127對R-123小腸吸收的影響，結(jié)果表

9、明125μg/mL維拉帕米、0.001％、0.1％、1％P123和0.001％、0.1F127均能在一定程度上提高R-123M→S透膜吸收，并可相應(yīng)提高R-123的小腸吸收率；同時通過增溶試驗(yàn)表明 P123和F127對水難溶性藥物有更大的增溶能力，更適合作為膠束載體材料。細(xì)胞膜的流動性試驗(yàn)表明濃度為0.001％-1％P123可以增加細(xì)胞膜的流動性，而F127對細(xì)胞膜流動性基本沒有影響，而且當(dāng)濃度升至1％時，還具有減小Caco-2細(xì)胞流動

10、性的趨勢。P-gpATP酶活性試驗(yàn)結(jié)果表明P123和F127可以不同程度的降低P-gpATP酶活性，但隨著載體材料濃度的增加，P-gpATP酶活性又有所恢復(fù)。說明載體材料可能通過這兩種機(jī)制抑制P-gp藥泵。P123膠束化前后對R-123跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究表明，P123膠束主要不是通過細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運(yùn)，P123膠束進(jìn)入細(xì)胞應(yīng)該涉及到網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞方式，而且具有能量依賴性，在一定程度上具有逃逸P-gp藥泵的作用。選用對P-gp藥泵有明顯抑制

11、作用的P123為載體材料制備ITZ-P123膠束，采用薄膜分散法在單因素考察的基礎(chǔ)上，以包封率、載藥量為指標(biāo)，采用星點(diǎn)設(shè)計-效應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)化處方，獲得較優(yōu)處方:P123為60mg，ITZ1mg，去離子水為17.5mL，溫度為60℃。優(yōu)化后膠束的載藥量大約為1.02％；為了提高PluronicP123的增溶能力和對P-gp的抑制作用，通過增溶試驗(yàn)、MTT試驗(yàn)、Caco-2細(xì)胞攝取試驗(yàn)進(jìn)行篩選，確定以P123/RH40=8:2，采用上述方法

12、制備了ITZ-P123/RH40混合膠束，處方為：P123與RH40分別為80mg和20mg，ITZ1.7mg，去離子水為3.5mL，溫度為66℃。優(yōu)化后膠束的載藥量大約為1.57％；體外釋放度試驗(yàn)表明：ITZ-P123膠束和ITZ-P123/RH40膠束在人工胃液中72h內(nèi)累積釋放百分率分別為87.5±7.％和71.2±5.4％，而在人工腸液中則無法檢測到；體外溶出試驗(yàn)表明：與市售Sporanox膠囊相比，在人工胃液和人工腸液中，兩種

13、膠束給藥系統(tǒng)的累積溶出百分率都達(dá)到100％，15min之內(nèi)基本全部溶出，不受pH影響。
　　 從單向灌流實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，與ITZ溶液相比，ITZ-P123膠束和ITZ-P123/RH40膠束可顯著提高ITZ吸收速率常數(shù)(Ka)和小腸有效滲透系數(shù)(Peff)，（p<0.05），說明膠束可以提高ITZ在小腸的吸收。但I(xiàn)TZ濃度為50μg/mL時的Ka和有keff均比5μg/mL組低，且Peff的差異比Ka更明顯，因此表明ITZ膠束的吸

14、收可能存在一定的飽和性。在ITZ-P123膠束和ITZ-P123/RH40膠束中加入維拉帕米后，對不同濃度的ITZ膠束的小腸吸收基本沒有明顯的影響，這說明載藥的P123和P123/RH40形成的膠束，不受P-gp抑制劑的影響，可以通過逃逸P-gp的藥泵外排作用增加P-gp底物的小腸吸收，這與前面Caco-2細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。單劑量灌胃給予大鼠Sporanox膠囊、ITZ-P123膠束和ITZ-P123/RH40膠束后，結(jié)果顯示，在禁

15、食和正常飲食狀態(tài)下，兩種膠束制劑其主要藥動學(xué)參數(shù)與Sporanox組具有明顯差異。相對于Sporanox組，在禁食狀態(tài)下，ITZ-P123膠束組AUC和Cmax明顯提高；而ITZ-P123/RH40膠束組無論是否禁食，都可顯著提高ITZ的AUC0-∞和Cmax；此外兩種膠束制劑也分別延長了ITZ在大鼠體內(nèi)的MRT及t1/2，這說明ITZ膠束不僅可以促進(jìn)藥物口服吸收，而且還可延長藥物在體內(nèi)的循環(huán)時間。
　　 綜上所述，本文篩選的P

16、luronic系列載體材料具有不同程度的P-gp抑制作用，因而可以促進(jìn)P-gp底物-R-123的跨膜吸收，但是試驗(yàn)結(jié)果也表明Pluronic載體材料在膠束化前后對藥物跨膜吸收的影響機(jī)制是不同的，形成膠束后可以通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞方式吸收，將抑制作用最強(qiáng)的P123及RH40為主要載體材料構(gòu)建了ITZ-P123膠束和ITZ-P123/RH40膠束給藥系統(tǒng)，結(jié)果表明兩種膠束給藥系統(tǒng)在大鼠小腸的吸收不受P-gp藥泵的影響，可以通過逃逸P-gp