四種抗結(jié)核藥物與P-糖蛋白相互作用的初步研究.pdf

1、一、目的： 通過考察四種抗結(jié)核藥物（異煙肼、左氧氟沙星、乙胺丁醇和吡嗪酰胺）對P-糖蛋白功能和表達的影響，以及進一步驗證利福平對P-糖蛋白功能和表達的誘導作用，初步研究四種抗結(jié)核藥物與P-糖蛋白的相互作用。 二、方法： 1、細胞培養(yǎng)及形態(tài)學驗證 為四種抗結(jié)核藥物對P-糖蛋白（P-gp）功能和表達的作用研究提供P-gp載體細胞和陰性對照細胞。 臍靜脈內(nèi)皮細胞（ECV304）和人結(jié)腸癌細胞（Caco-

2、2）分別采用1640培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基進行常規(guī)培養(yǎng)；細胞免疫熒光法進行細胞膜上P-gp表達驗證。 2、細胞毒性試驗 采用苯基溴化四氮唑藍法（MTT）分別考察四種抗結(jié)核藥物、利福平和維拉帕米對Caco-2細胞的毒性，以確定其體外最大無毒濃度（即細胞存活率大于90％的藥物濃度），保證試驗過程中細胞的活力。 3、四種抗結(jié)核藥物對P-糖蛋白功能的影響 采用流式細胞儀測定細胞內(nèi)熒光強度，以利福平作為P-gp功能誘

3、導的陽性對照，維拉帕米作為P-gp功能抑制的陽性對照，分別考察四種抗結(jié)核藥物對經(jīng)典P-gp功能探針藥物--羅丹明-123（Rh-123）攝取作用的影響，從而判斷P-gp功能的變化。 4、從蛋白水平研究四種抗結(jié)核藥物對P-糖蛋白表達的影響 以利福平作為P-gp表達上調(diào)的陽性對照，維拉帕米作為P-gp表達下調(diào)的陽性對照，不加藥處理的Caco-2細胞作為陰性對照，采用流式細胞術(shù)分別分析四種抗結(jié)核藥物對Caco-2細胞上P-gp

4、表達的影響。 5、從mRNA水平研究四種抗結(jié)核藥物對MDR1 mRNA表達的影響 以利福平作為MDR1基因mRNA上調(diào)的陽性對照，維拉帕米作為MDR1基因mRNA下調(diào)的陽性對照，不加藥處理的Caco-2細胞作為陰性對照，采用實時熒光定量PCR技術(shù)分別分析四種抗結(jié)核藥物對Caco-2細胞MDR1基因mRNA水平表達的影響。 三、結(jié)果： 1、細胞培養(yǎng)及形態(tài)學驗證 Caco-2細胞和ECV304細胞在

5、正常條件下生長旺盛；Caco-2細胞高表達P-gp，可用于研究四種抗結(jié)核藥物對P-gp功能和表達的影響；ECV304細胞低表達P-gp，適合作為陰性對照細胞。 2、細胞毒性試驗 3d的MTT結(jié)果顯示四種抗結(jié)核藥物、利福平及維拉帕米對Caco-2細胞的最大無毒濃度分別為： 異煙肼（INH）150μmol/L，左氧氟沙星（LVFX）5μmol/L，乙胺丁醇（EMB）150μmol/L，吡嗪酰胺（PZA）200μmol

6、/L，利福平（RFP）100μmol/L，維拉帕米（VER）10μmol/L。 因此，在后續(xù)的10d、20dMTT實驗中選擇用于長期含藥培養(yǎng)的四種抗結(jié)核藥物、利福平及維拉帕米的濃度分別為：INH為80μmol/L，LVFX為2μmol/L，EMB為30μmol/L，PZA為100μmol/L（各藥物濃度均接近人常規(guī)劑量給藥后的血藥峰濃度）；RFP為10μmol/L，VER為10μmol/L。最終的MTT結(jié)果顯示：各細胞存活率均大

7、于90％。因此，選擇的各藥物濃度適用于研究長期的含藥培養(yǎng)對P-gp功能和表達的影響。 3、四種抗結(jié)核藥物對P-糖蛋白功能的影響 作用1h后，四種抗結(jié)核藥物顯著減少了Rh-123在Caco-2細胞內(nèi)的蓄積（P<0.05），說明四種抗結(jié)核藥物均增強了P-gp的外排功能，即對其功能有誘導作用； 作用3d后，四種抗結(jié)核藥物反而都增加了Rh-123在Caco-2細胞內(nèi)的蓄積（P<0.05），說明隨著作用時間延長，四種抗結(jié)核

8、藥物又削弱了P-gp的外排功能，即對其功能有抑制作用； 作用10d后，LVFX仍然是增加了Rh-123在Caco-2細胞內(nèi)的蓄積（P<0.05），為抑制作用；而其他三種抗結(jié)核藥物則都減少了Rh-123在Caco-2細胞內(nèi)的蓄積（P<0.05），轉(zhuǎn)為誘導作用； 作用20d后，LVFX仍為抑制作用（P<0.05）； INH、EMB和PZA仍為誘導作用（P<0.05）。 4、四種抗結(jié)核藥物對P-糖蛋白表達的影響

9、 作用1h后，四種抗結(jié)核藥物分別干預組與陰性對照組比較，P-gp的表達量差異沒有統(tǒng)計學意義，說明瞬時（1h）的藥物干預對P-gp的表達量幾乎沒有影響； 作用3d后，四種抗結(jié)核藥物均下調(diào)了Caco-2細胞上P-gp的表達（P<0.05），各組的P-gp表達量僅為陰性對照組的40％左右； 作用10d后，INH、EMB和PZA均上調(diào)了Caco-2細胞上P-gp的表達（P<0.05），其中INH、EMB的P-gp表達量約為陰性對

10、照組的4～7倍，PZA約為陰性對照組的1.4倍；而LVFX則下調(diào)了Caco-2細胞上P-gp的表達（P<0.05），其P-gp表達量約為陰性對照組的50％； 作用20d后，INH、EMB、PZA均上調(diào)了Caco-2細胞上P-gp的表達（P<0.05），其中INH、EMB的P-gp表達量約為陰性對照組的4倍，PZA約為陰性對照組的1.2倍；而LVFX則下調(diào)了Caco-2細胞上P-gp的表達（P<0.05），其P-gp表達量約為陰性

11、對照組的50％。 5、四種抗結(jié)核藥物對MDR1 mRNA表達的影響 作用1h后，四種抗結(jié)核藥物干預組與陰性對照組比較，MDR1 mRNA的表達量差異沒有統(tǒng)計學意義，說明瞬時（1h）的藥物干預對MDR1 mRNA的表達量也幾乎沒有影響； 作用3d后，四種抗結(jié)核藥物均下調(diào)了Caco-2細胞上MDR1mRNA的表達（P<0.05），各組的MDR1 mRNA表達量僅為陰性對照組的30％左右； 作用10d后，INH

12、、EMB和PZA均上調(diào)了Caco-2細胞上P-gp的表達（P<0.05），其中INH、EMB的MDR1 mRNA的表達量為陰性對照組的12倍，PZA約為陰性對照組的1.3倍；而LVFX則下調(diào)了Caco-2細胞上MDR1 mRNA的表達（P<0.05），其MDR1 mRNA表達量約為陰性對照組的30％； 作用20d后，INH、EMB和PZA均上調(diào)了Caco-2細胞上P-gp的表達（P<0.05），其中INH、EMB的MDR1 mR