家兔PepT1的原核表達及日齡、蛋白對PepT1 mRNA表達量的影響.pdf

1、mRNA及蛋白質(zhì)表達定量技術(shù)是研究家兔氨基酸吸收及PepT1轉(zhuǎn)運特性的必要技術(shù)手段，本研究采用Real Time PCR方法測定了不同日齡的家兔腸道內(nèi)PepT1、CATI、EAAC1mRNA的表達量及不同飼糧蛋白水平下的腸道內(nèi)PepT1、CAT1、EAAC1mRNA的表達量。分析年齡、腸道不同部位、不同的飼糧蛋白水平對家兔小肽、堿性氨基酸、酸性氨基酸吸收的影響。為了從蛋白水平上研究小肽的吸收，本研究通過基因工程的方法建立了通過原核表達獲

2、得家兔PepT1蛋白的模型，為獲取蛋白抗體，并通過蛋白水平研究家兔小肽的吸收奠定基礎(chǔ)。
　　不同日齡家兔消化道各段PepT1、CAT1、EAAC1 mRNA的表達量分析（試驗一）。試驗用家兔自斷奶開始維持飼料的同質(zhì)化，并統(tǒng)一自由采食。通過熒光定量PCR的方法測定15、30、60、90日齡胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸內(nèi)PepT1、CAT1、EAAC1mRNA的表達量。結(jié)果表明，同一日齡腸道各段的表達量結(jié)果，PepT1的表達量

3、:相同日齡不同消化道之間進行表達量分析，結(jié)果各組均為回腸的表達量最(P＜0.05)。相同腸段不同日齡之間進行表達量分析，結(jié)果除結(jié)腸隨年齡的增加表達量有逐漸遞增的趨勢外(P＞0.05)，其余各組均在60日齡時表達量達到峰值(P＜0.05)。CAT1mRNA的表達量:相同日齡不同消化道之間進行表達量分析，結(jié)果除15日齡胃中表達量最高(P＜0.05)，其余各日齡中十二指腸的表達量最高(P＜0.05)。相同腸段不同日齡之間進行表達量分析，在胃中

4、15日齡表達量最高(P＜0.05)，盲腸在30日齡表達量最高，十二指腸、回腸、空腸、結(jié)腸在60日齡時表達量最高(P＜0.05)。EAAC1mRNA的表達量:相同日齡不同消化道之間進行表達量分析，15日齡、60日齡中空腸的表達量最高(P＜0.05)，30日齡、90日齡中回腸表達量最高(P＜0.05)，各組均為空腸、回腸表達量相對較高。相同腸段不同日齡之間進行表達量分析，、胃、盲腸中15日齡表達量最高，回腸30日齡表達量最高(P＜0.05)

5、，十二指腸、空腸、結(jié)腸中60日齡表達量最高(P＜0.05)。
　　不同飼糧蛋白水平對家兔消化道各段PepT1、CAT1、EAAC1 mRNA的表達量的影響（試驗二）。設(shè)計飼糧配方，試驗分三組:低蛋白水平組、對照組、高蛋白水平組。飼糧蛋白水平設(shè)計梯度為12.8％、16％、19.2％。實測蛋白濃度值為12.4％、15.3％、17.8％。試驗每組30只家兔，試驗兔為斷奶1月齡泰山大白兔，每天等量飼喂，試驗共進行40天，每組八只屠宰采取腸

6、道各組織樣品。通過熒光定量PCR的方法測定十二指腸、空腸、回腸內(nèi)PepT1、CAT1、EAAC1mRNA的表達量。結(jié)果表明，CAT1:十二指腸中對照組表達量最高，空腸、回腸中隨蛋白水平的升高表達量有升高的趨勢(P＜0.05)。EAAC1:在小腸中中隨蛋白水平的升高表達量差異不顯著(P＞0.05)，PepT1:在十二指腸、空腸、回腸中均為對照組表達量最高。
　　家兔PepTI的克隆及原核表達（試驗三）。通過RT-PCR技術(shù)擴增家兔Ⅰ

7、型肽載體CDS區(qū)編碼片段，并且通過原核表達獲得重組家兔Ⅰ型肽載體蛋白，奠定制備多克隆抗體的基礎(chǔ)。結(jié)果表明，成功擴增出2001bp家兔PepT1部分CDS編碼區(qū)及用于原核表達的1071bp抗原表位相對集中的基因片段;克隆載體經(jīng)過DNA序列鑒定，所得基因與NCBI報道的完全一致;成功構(gòu)建表達載體pET-32a-M、pET-28a-M;經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，表達出了6@His-M融合蛋白，用組氨酸標簽抗體做Western印記證明產(chǎn)物大約44 ku，