家兔PepT1的原核表達(dá)及日齡、蛋白對(duì)PepT1 mRNA表達(dá)量的影響.pdf

1、mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)定量技術(shù)是研究家兔氨基酸吸收及PepT1轉(zhuǎn)運(yùn)特性的必要技術(shù)手段，本研究采用Real Time PCR方法測(cè)定了不同日齡的家兔腸道內(nèi)PepT1、CATI、EAAC1mRNA的表達(dá)量及不同飼糧蛋白水平下的腸道內(nèi)PepT1、CAT1、EAAC1mRNA的表達(dá)量。分析年齡、腸道不同部位、不同的飼糧蛋白水平對(duì)家兔小肽、堿性氨基酸、酸性氨基酸吸收的影響。為了從蛋白水平上研究小肽的吸收，本研究通過基因工程的方法建立了通過原核表達(dá)獲

2、得家兔PepT1蛋白的模型，為獲取蛋白抗體，并通過蛋白水平研究家兔小肽的吸收奠定基礎(chǔ)。
　　不同日齡家兔消化道各段PepT1、CAT1、EAAC1 mRNA的表達(dá)量分析（試驗(yàn)一）。試驗(yàn)用家兔自斷奶開始維持飼料的同質(zhì)化，并統(tǒng)一自由采食。通過熒光定量PCR的方法測(cè)定15、30、60、90日齡胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸內(nèi)PepT1、CAT1、EAAC1mRNA的表達(dá)量。結(jié)果表明，同一日齡腸道各段的表達(dá)量結(jié)果，PepT1的表達(dá)量

3、:相同日齡不同消化道之間進(jìn)行表達(dá)量分析，結(jié)果各組均為回腸的表達(dá)量最(P＜0.05)。相同腸段不同日齡之間進(jìn)行表達(dá)量分析，結(jié)果除結(jié)腸隨年齡的增加表達(dá)量有逐漸遞增的趨勢(shì)外(P＞0.05)，其余各組均在60日齡時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值(P＜0.05)。CAT1mRNA的表達(dá)量:相同日齡不同消化道之間進(jìn)行表達(dá)量分析，結(jié)果除15日齡胃中表達(dá)量最高(P＜0.05)，其余各日齡中十二指腸的表達(dá)量最高(P＜0.05)。相同腸段不同日齡之間進(jìn)行表達(dá)量分析，在胃中

4、15日齡表達(dá)量最高(P＜0.05)，盲腸在30日齡表達(dá)量最高，十二指腸、回腸、空腸、結(jié)腸在60日齡時(shí)表達(dá)量最高(P＜0.05)。EAAC1mRNA的表達(dá)量:相同日齡不同消化道之間進(jìn)行表達(dá)量分析，15日齡、60日齡中空腸的表達(dá)量最高(P＜0.05)，30日齡、90日齡中回腸表達(dá)量最高(P＜0.05)，各組均為空腸、回腸表達(dá)量相對(duì)較高。相同腸段不同日齡之間進(jìn)行表達(dá)量分析，、胃、盲腸中15日齡表達(dá)量最高，回腸30日齡表達(dá)量最高(P＜0.05)

5、，十二指腸、空腸、結(jié)腸中60日齡表達(dá)量最高(P＜0.05)。
　　不同飼糧蛋白水平對(duì)家兔消化道各段PepT1、CAT1、EAAC1 mRNA的表達(dá)量的影響（試驗(yàn)二）。設(shè)計(jì)飼糧配方，試驗(yàn)分三組:低蛋白水平組、對(duì)照組、高蛋白水平組。飼糧蛋白水平設(shè)計(jì)梯度為12.8％、16％、19.2％。實(shí)測(cè)蛋白濃度值為12.4％、15.3％、17.8％。試驗(yàn)每組30只家兔，試驗(yàn)兔為斷奶1月齡泰山大白兔，每天等量飼喂，試驗(yàn)共進(jìn)行40天，每組八只屠宰采取腸

6、道各組織樣品。通過熒光定量PCR的方法測(cè)定十二指腸、空腸、回腸內(nèi)PepT1、CAT1、EAAC1mRNA的表達(dá)量。結(jié)果表明，CAT1:十二指腸中對(duì)照組表達(dá)量最高，空腸、回腸中隨蛋白水平的升高表達(dá)量有升高的趨勢(shì)(P＜0.05)。EAAC1:在小腸中中隨蛋白水平的升高表達(dá)量差異不顯著(P＞0.05)，PepT1:在十二指腸、空腸、回腸中均為對(duì)照組表達(dá)量最高。
　　家兔PepTI的克隆及原核表達(dá)（試驗(yàn)三）。通過RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增家兔Ⅰ

7、型肽載體CDS區(qū)編碼片段，并且通過原核表達(dá)獲得重組家兔Ⅰ型肽載體蛋白，奠定制備多克隆抗體的基礎(chǔ)。結(jié)果表明，成功擴(kuò)增出2001bp家兔PepT1部分CDS編碼區(qū)及用于原核表達(dá)的1071bp抗原表位相對(duì)集中的基因片段;克隆載體經(jīng)過DNA序列鑒定，所得基因與NCBI報(bào)道的完全一致;成功構(gòu)建表達(dá)載體pET-32a-M、pET-28a-M;經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)出了6@His-M融合蛋白，用組氨酸標(biāo)簽抗體做Western印記證明產(chǎn)物大約44 ku，