殼聚糖對視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞生長的促進(jìn)作用及其作為基因載體的初步研究.pdf

1、目的:研究殼聚糖對體外分層及純化培養(yǎng)的鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞生長的促進(jìn)作用;制備載基因殼聚糖納米粒,研究其特性及其對質(zhì)粒gp130-pDNA3.1的保護(hù)能力。
　　方法:取SD乳鼠視網(wǎng)膜,在解剖顯微鏡下將視網(wǎng)膜分成內(nèi)、外兩層,分別將內(nèi)外層及全層視網(wǎng)膜制成細(xì)胞懸液,各自進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組加入含10％殼聚糖的完全培養(yǎng)基,對照組不加殼聚糖。每天觀察細(xì)胞生長狀態(tài),MTT法檢測細(xì)胞存活率。各層細(xì)胞分別用Thy1.1抗體鑒定神經(jīng)節(jié)細(xì)胞,計(jì)算各層細(xì)胞

2、的節(jié)細(xì)胞率。兩步法提純視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。計(jì)算提純率。提純后分別加入含10%血清、10%殼聚糖及鼠神經(jīng)生長因子(NGF)的培養(yǎng)基,觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。
　　復(fù)凝集法制備殼聚糖納米粒,測定其粒徑大小及zata電位;計(jì)算包封率,凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)觀察殼聚糖對質(zhì)粒gp130-pDNA3.1的包裹能力,DNAaseⅠ消化實(shí)驗(yàn)觀察殼聚糖對質(zhì)粒的保護(hù)作用。
　　結(jié)果:分層培養(yǎng)細(xì)胞的存活率:各層細(xì)胞第1、2d存活率最高,MTT示:OD外層1.189

3、±0.158,OD內(nèi)層1.084±0.150,OD全層1.381±0.089;3d后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,細(xì)胞存活率逐漸降低(P<0.05):外層OD3d 0.835±0.120,OD4d 0.805±0.116,OD5d 0.782±0.107;內(nèi)層:OD3d 0.388±0.095,OD4d 0.371±0.084,OD5d 0.347±0.052;全層:OD3d 0.523±0.047,OD4d 0.340±0.084,OD5d 0

4、.227±0.057;相同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組(殼聚糖組)比對照組(不含殼聚糖)的存活率高(P<0.05)。經(jīng)免疫組化鑒定,內(nèi)層細(xì)胞節(jié)細(xì)胞率最高(19.248±0.999)%,其次為全層(4.986±0.635)%,外層節(jié)細(xì)胞率最低(0.748±0.177)%。兩步法提純神經(jīng)節(jié)細(xì)胞:提純率可達(dá)95%以上。純化的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)48h后測量最大軸突長度,殼聚糖組:62.5μm;NGF組:37.5μm;空白對照組:12.5μm。
　　復(fù)凝集法制

5、備的載基因殼聚糖納米粒分布均勻,平均直徑約719nm,zata電位約17.2±0.8mV;包封率可達(dá)100%,瓊脂糖凝膠電泳顯示殼聚糖與gp130-pDNA3.1能有效結(jié)合;被殼聚糖包裹的gp130-pDNA3.1不會(huì)被DNAaseⅠ降解。
　　結(jié)論:混合培養(yǎng)的各層細(xì)胞中,內(nèi)層細(xì)胞的節(jié)細(xì)胞率最高。在混合培養(yǎng)的各層細(xì)胞中加入殼聚糖,能促進(jìn)其生長并提高存活率。加入殼聚糖或NGF后,能提高純化的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存活率。
　　復(fù)凝集法制