吡格列酮對(duì)糖尿病大鼠腎小球足細(xì)胞保護(hù)及其與抗炎、抗纖維化作用的關(guān)系.pdf

1、目的:研究不同劑量鹽酸吡格列酮(PIO)對(duì)鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟腎小球足細(xì)胞的保護(hù)及其與抗炎和抗纖維化的關(guān)系。
　　方法:健康清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(n=50)禁食12小時(shí)后,隨機(jī)挑選8只作為正常對(duì)照組(NC組)給予無菌枸櫞酸緩沖液腹腔注射,余下42只大鼠一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)65mg/kg。72小時(shí)后測尾外周血,血糖≥16.7mmol/L并出

2、現(xiàn)多飲多尿等表現(xiàn)者入選為1型糖尿病大鼠模型,隨機(jī)分為四組:糖尿病模型對(duì)照組(DM組,n=8),3個(gè)不同劑量PIO干預(yù)組(DR1,DR2,DR3組,PIO劑量分別為:10,20,30mg/kg/d,n=8)。造模后第七天記為0周,分別于0,4,8周末測外周血血糖,并且收集大鼠尿液,測定尿白蛋白(urinary albumin,UAlb)、尿nephrin(urinary nephrin,Unep)、尿MCP-1(urinary MCP-1

3、,Umcp-1)、尿TGF-β1(urinary TGF-β1,UTGF-β1)和尿肌酐(urinary creatinine,UCr)水平。為消除尿量的差異,Ualb、Unep、Umcp-1和UTGF-β1均通過UCr校正并分別簡稱尿白蛋白肌酐比(urinary albumin/creatinine ratio UACR),尿nephrin肌酐比(urinary nephrin/creatinine ratio,UNER),尿MCP-

4、1肌酐比(urinary MCP-1/creatinine ratio,UMCR)和尿TGF-β1肌酐比(urinary TGF-β1/creatinine ratio,UTGR),實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)態(tài)監(jiān)測大鼠血糖。8周末水合氯醛(300mg/kg)麻醉大鼠,腹主動(dòng)脈取血檢測空腹血糖(fasting blood glucose,FBG),糖化血紅蛋白A1c(glycosylated hemoglobin A1c,HbA1c),甘油三酯(tri

5、glyceride,TG),總膽固醇(total cholesterol,TC),高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C),低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C),血肌酐(serum creatinine,SCr),尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)。處死大鼠留取左腎并計(jì)算腎臟肥大指數(shù)

6、(kidney hypertrophy index,KI),光鏡和電鏡觀察腎臟病理變化并計(jì)算平均腎小球截面積(mean glomerular cross-sectional area,MGA),平均體積(mean glomerular volume,MGV),腎小球基底膜厚度(glomerular basement membrane thickness,GBMT)和足突融合率(foot process fusion rate,FPFR)

7、。分別應(yīng)用免疫組化和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測腎組織nephrin mRNA水平及腎組織中nephrin蛋白、MCP-1蛋白、TGF-β1蛋白含量。
　　結(jié)果:(1)4組糖尿病大鼠(DM,DR1,DR2和DR3組)0,4,8周末外周血糖及8周末HbA1c均明顯高于正常對(duì)照組(NC組)(P<0.01),而4組糖尿病大鼠間的差異

8、無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　(2)8周末,4組糖尿病大鼠的SCr,BUN,TG,LDL-C均高于NC組,HDL-C低于NC組。各PIO組TG均明顯低于DM組(P<0.01,P<0.05),DR2及DR3組HDL-C水平高于DM組(P<0.05)。
　　(3)0周時(shí),5組UACR水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;自4周末至8周末,4組糖尿病大鼠UACR均顯著高于NC組(均P<0.01);4周末,DR2組和DR3組UACR顯著低于D

9、M組(均P<0.01),DR1組UACR雖低于DM組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;8周末,DR1,DR2和DR3組UACR均顯著低于DM組(均P<0.01),且DR2,DR3組均低于DR1組(P<0.05)。
　　(4)8周末,電鏡下NC組腎小球基底膜結(jié)構(gòu)清晰,足突完整,基本無足突融合。與NC組相比,各糖尿病組均可見到腎小球毛細(xì)血管基底膜模糊不清,各處有不規(guī)則性增厚,可見足突破壞及融合,基底膜厚度(GBMT)及足突融合率(FPFR)均明顯

10、高于NC組(P<0.01),各PIO組其腎小球GBMT,FPFR均高于NC組(P<0.05,P<0.01),但明顯低于DM組(P<0.01),且DR2及DR3組低于DR1組(均P<0.01)。
　　(5)0周時(shí),5組大鼠尿中均檢測到nephrin,但差異無顯著性;4周末各PIO干預(yù)組UNER排泄均顯著低于DM組(P<0.05),但各干預(yù)組間差異無顯著性;8周末UNER,UMCR和UTGR在各PIO干預(yù)組均較DM組顯著降低(P<0.

11、05);與DR1組相比,UNER和UMCR在DR2和DR3組均顯著降低(P<0.05),而DR2與DR3組間差異無顯著性(P>0.05)。UTGR各劑量PIO干預(yù)組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)
　　(6)免疫組化結(jié)果:8周末,通過Image pro plus 6.0檢測圖像中陽性反應(yīng)部位的累積光密度(integrated optical density,IOD):
　?、倌I臟nephrin蛋白IOD值:NC組>各PI

12、O組>DM組(P<0.05),DR1、DR2和DR3組間IOD無明顯差異;
　　②腎臟MCP-1蛋白IOD值:DM組>各PIO組>NC組(P<0.05),DR1、DR2和DR3組間IOD無明顯差異;
　　③腎臟TGFβ1蛋白IOD值:DM組>各PIO組>NC組(P<0.05),DR1、DR2和DR3組間IOD無明顯差異。
　　(7)半定量RT-PCR:8周末,與NC組比較,糖尿病鼠nephrin mRNA水平均增高(P

13、<0.05),且PIO干預(yù)組低于DM組(P<0.05)),各PIO組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(8)Pearson相關(guān)分析顯示:
　　①UNER與UACR、KI呈顯著正相關(guān)(r=0.881,P<0.01;r=0.833,P<0.01)。
　?、赨NER與UMCR呈顯著正相關(guān)(r=0.729,P<0.01)。
　?、踀NER與UTGR呈顯著正相關(guān)(r=0.787,P<0.01)。
　?、苣I組織nephrin

14、蛋白與MCP-1蛋白呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.696,P<0.01)。
　?、菽I組織nephrin蛋白與TGF-β1蛋白呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.669,P<0.01)。
　　結(jié)論:(1)PIO對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎小球足細(xì)胞具有保護(hù)作用,并具有一定的劑量依賴性,且獨(dú)立于其降血糖作用。
　　(2)吡格列酮對(duì)糖尿病大鼠足細(xì)胞的保護(hù)可能與抑制nephrin隨尿排泄、調(diào)節(jié)腎組織nephrin mRNA及蛋白表達(dá)作用有關(guān),該作