黃芪甲苷對(duì)早期糖尿病大鼠足細(xì)胞保護(hù)作用的研究.pdf

1、目的：慢性腎臟病(CKD)流行趨勢(shì)日益嚴(yán)峻，糖尿病腎病(DN)已逐步超越慢性腎小球腎炎成為CKD的首要病因。足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過(guò)屏障的重要組成成分，位于腎小球?yàn)V過(guò)屏障的最外層，其胞體伸出相互交錯(cuò)的指突狀足突，覆蓋于腎小球基底膜(GBM)上。整合素α3β1分布在足細(xì)胞與GBM相連的基底部，是足細(xì)胞粘附于GBM的主要粘附分子。整合素α3β1是跨膜蛋白，是由α鏈及β鏈構(gòu)成的異二聚體。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究顯示，在DN早期即出現(xiàn)足細(xì)胞數(shù)目減少。因足細(xì)胞為

2、終分化細(xì)胞，損傷后一般很難再生，隨著疾病病程進(jìn)展，足細(xì)胞數(shù)目持續(xù)減少，腎小球GBM逐漸裸露，濾過(guò)膜完整性被破壞，導(dǎo)致蛋白尿的形成，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在疾病發(fā)展進(jìn)程中伴有整合素α3β1表達(dá)的減低。由此可見(jiàn)，足細(xì)胞在DN蛋白尿發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要角色。雖然如此，目前尚無(wú)針對(duì)足細(xì)胞損傷、數(shù)目減少的特異性的藥物。祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，黃芪以其益氣固表、斂汗固脫、托瘡生肌、利水消腫之功效，成為臨床治療DN的常用中藥之一，但其治療機(jī)制至今尚不明確。黃芪甲苷(A

3、S-IV)為黃芪的主要活性成份，前期研究顯示:AS-IV可改善高糖刺激下足細(xì)胞的黏附功能紊亂，其改善作用部分歸因于整合素α3β1表達(dá)的上調(diào)。上述研究對(duì)象為體外培養(yǎng)足細(xì)胞，現(xiàn)進(jìn)一步探討AV-IS對(duì)活體早期DN大鼠足細(xì)胞是否同樣具有上述保護(hù)作用，為早期DN的防治開(kāi)辟一條新途徑。
　　方法：體重180g-200g健康雄性SD大鼠45只隨機(jī)分為正常對(duì)照組、糖尿病腎病組和黃芪甲苷治療組。按65mg/Kg體重一次性腹腔注射溶于pH4.2，0.

4、1mol/L檸檬酸沖液中的鏈脲酶素(STZ)（美國(guó)sigma公司）建立糖尿病模型。STZ注射后72h后空腹血糖＞300mg/dl且于2周后尿白蛋白/肌酐比值＞30μg/mg者認(rèn)為糖尿病腎病造模成功。黃芪甲苷用1％CMC（羧甲基纖維素）配置。黃芪甲苷治療組大鼠在造模前2周即予AS-IV10mg·kg-1·d-1灌胃預(yù)處理。所有大鼠均飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。于造模后第6周末、12周末代謝籠內(nèi)收集24h尿量，自動(dòng)生化儀檢測(cè)24h尿蛋白;造模

5、后第6周末、12周末測(cè)各組隨機(jī)選取5只大鼠，以脊椎脫臼法處死大鼠，留取血標(biāo)本檢測(cè)血尿素氮、肌苷、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶;取腎組織，左腎以長(zhǎng)徑為中心線對(duì)剖，分別于甲醛及戊二醛中固定，制作石蠟切片和電鏡切片。石蠟切片HE、Masson、PAS、PASM染色，光鏡觀察腎臟病理變化。電鏡觀察足細(xì)胞形態(tài)變化;右腎-80℃冰凍保存用于WT1免疫組織化學(xué)染色觀察腎小球足細(xì)胞密度變化、Western Blot測(cè)定大鼠腎皮質(zhì)α3β1整合素蛋白的表達(dá)變化、

6、RealTime PCR檢測(cè)α3β1整合素mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果：與正常對(duì)照組相比，造模后第6周末糖尿病組大鼠24h尿蛋白(1630±325mg/24h)較正常對(duì)照組大鼠(320±41mg/24h)顯著升高，造模后第12周末24h尿蛋白量(2455±794mg/24h)進(jìn)一步上升。而AS-IV治療組大鼠24h蛋白尿水平在造模后第6周（1053±257mg/24h)即較DN組顯著下降,在第12周末24h尿蛋白為1103±498mg