環(huán)孢菌素A對人NK、外周血淋巴細(xì)胞ILT3-4表達(dá)及功能影響的實(shí)驗(yàn)和臨床研究.pdf

1、目的：
　　 免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄子(ILTs)是最近發(fā)現(xiàn)的一類受體家族，主要表達(dá)于髓系和淋巴系細(xì)胞表面，其成員通過與相應(yīng)配體結(jié)合，在誘導(dǎo)免疫活性T、NK細(xì)胞分別轉(zhuǎn)化為Treg和耐受性NK細(xì)胞，促進(jìn)NK、T細(xì)胞的凋亡等發(fā)揮著廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用。環(huán)孢菌素A(CsA)是一種臨床常用的免疫抑制劑，多用于器官移植后抗排斥反應(yīng)，治療自身免疫性疾病等。以往研究表明抑制性受體ILT3和ILT4可使宿主對外源性的器官產(chǎn)生耐受，上調(diào)其表達(dá)可提高移植成

2、功率。關(guān)于CsA對機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)以往雖有研究，但該藥物對人淋巴細(xì)胞ILTs表達(dá)的影響未見報道。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，體外實(shí)驗(yàn)中以自然殺傷細(xì)胞(NKL)為研究對象，分別用不同濃度CsA處理NKL細(xì)胞，檢測用藥前后細(xì)胞抑制性受體ILT3和ILT4表達(dá)、NKL細(xì)胞增殖及其對腫瘤細(xì)胞殺傷功能的變化;同時，動態(tài)檢測腎移植患者（使用CsA抗排斥反應(yīng)）手術(shù)前后外周血淋巴細(xì)胞ILT3和ILT4mRNA的表達(dá)變化，比較腎移植術(shù)后穩(wěn)定組與排斥組IL

3、T3/4表達(dá)差異，分析ILT3/4的表達(dá)與腎移植術(shù)后排斥反應(yīng)的聯(lián)系，探討ILT3/4在診斷排斥反應(yīng)中的應(yīng)用。該研究對探索CsA的作用機(jī)制及其合理應(yīng)用具有重要參考價值，對腎移植術(shù)后排斥反應(yīng)的早期診斷具有顯著的臨床意義。
　　 方法：
　　 一、體外實(shí)驗(yàn):
　　 1、分別用濃度為5、10、15mg/L的CsA處理NKL細(xì)胞12h、24h、36h后，采用定量PCR和流式細(xì)胞術(shù)，分別檢測用藥前后NKL細(xì)胞抑制性受體ILT

4、3和ILT4mRNA和蛋白的表達(dá);
　　 2、測定腫瘤細(xì)胞BGC-823和JEG-3上HLA-G的表達(dá)，并選擇經(jīng)濃度為15mg/L的CsA處理36h前后的NKL細(xì)胞分別與表達(dá)不同程度HLA-G的腫瘤細(xì)胞BGC-823和JEG-3共培養(yǎng)，采用MTT法檢測藥物處理前后NKL細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞BGC-823和JEG-3殺傷活性變化;
　　 3、MTT法檢測經(jīng)不同濃度CsA處理前后的NKL細(xì)胞增殖活性的變化。
　　 二、臨床

5、實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)分組包括實(shí)驗(yàn)組、健康對照組及術(shù)前對照組。其中實(shí)驗(yàn)組來自齊魯醫(yī)院器官移植中心接受腎移植的患者，根據(jù)患者術(shù)后恢復(fù)情況又分為術(shù)后排斥組和術(shù)后穩(wěn)定組;隨機(jī)選取山東大學(xué)齊魯醫(yī)院健康體檢職工作為健康對照組。采用實(shí)時熒光定量PCR法檢測腎移植患者手術(shù)前后（術(shù)后1天、1周、3周、1個月、兩個月及3個月）、發(fā)生排斥反應(yīng)前后（排斥發(fā)生時、發(fā)生后1天、3天、7天）及健康對照組外周血淋巴細(xì)胞ILT3和ILT4mRNA的表達(dá)變化。同時檢測各研究對象同期

6、外周血CsA藥物濃度及血清肌酐和尿素氮等指標(biāo)，分析ILT3和ILT4在移植排斥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展及臨床診斷中的作用。所取標(biāo)本均經(jīng)研究對象同意，符合山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會要求。
　　 結(jié)果：
　　 1、CsA可上調(diào)NKL細(xì)胞ILT3和ILT4的表達(dá)，且上調(diào)幅度與處理時間、藥物濃度相關(guān)。其中15mg/L的CsA處理NKL細(xì)胞36h后，細(xì)胞ILT3和ILT4表達(dá)明顯升高;
　　 2、對同一種靶細(xì)胞，經(jīng)濃度為15mg/L

7、的CsA處理后的NKL細(xì)胞殺傷效率較處理前明顯下降;藥物處理前后的NKL對低表達(dá)HLA-G的BGC-823細(xì)胞殺傷力均強(qiáng)于對高表達(dá)HLA-G的JEG-3細(xì)胞的殺傷;
　　 3、各濃度組CsA不同程度的抑制NKL細(xì)胞的增殖，同一時間段，隨著CsA濃度的增大，對NKL細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)，呈一定的劑量效應(yīng);且同一濃度處理NKL細(xì)胞時間越長，抑制其增殖的作用越明顯;
　　 4、臨床實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組與對照組中不同個體ILT3

8、/4mRNA表達(dá)水平高低不一，存在較大個體差異。但整體來看，術(shù)前對照組ILT3/4mRNA表達(dá)與健康人對照組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;
　　 5、術(shù)后功能穩(wěn)定組:術(shù)后1天，ILT3mRNA表達(dá)較術(shù)前無明顯變化，ILT4mRNA略升高;術(shù)后7天ILT3/4mRNA與術(shù)前水平相比均有升高;隨后，ILT3/4mRNA表達(dá)水平持續(xù)上升，于術(shù)后大約一個月達(dá)到最高表達(dá)水平;術(shù)后2個月及3個月，ILT3/4表達(dá)水平基本保持穩(wěn)定，分別約為術(shù)前的1.69

9、～1.73、2.06～2.12倍;
　　 6、術(shù)后排斥反應(yīng)組:從術(shù)后到排斥反應(yīng)發(fā)生前各時間段ILT3/4mRNA表達(dá)水平與穩(wěn)定組相應(yīng)時間段無顯著差異;出現(xiàn)排斥時ILT3/4mRNA的表達(dá)水平明顯低于排斥前穩(wěn)定水平，同時也略低于術(shù)前水平。隨后，患者在使用適量免疫抑制劑后ILT3/4的表達(dá)呈現(xiàn)不同程度的上升。
　　 結(jié)論：
　　 1、CsA可上調(diào)NKL細(xì)胞上ILT3和ILT4的表達(dá)，并通過ILT3和/或ILT4參與對

10、NKL細(xì)胞殺傷及增殖功能的調(diào)節(jié)，同時ILT3和/或ILT4可與HLA-G相互作用影響NKL細(xì)胞對腫瘤的殺傷功能。另外，ILT3/4上調(diào)幅度與藥物濃度等相關(guān)。這將為探討CsA作用機(jī)制及其在臨床上的合理應(yīng)用提供重要參考價值;
　　 2、動態(tài)檢測腎移植患者術(shù)前、術(shù)后及排斥反應(yīng)發(fā)生前后外周血淋巴細(xì)胞ILT3/4表達(dá)變化結(jié)果發(fā)現(xiàn):移植術(shù)后穩(wěn)定組患者外周血淋巴細(xì)胞ILT3/4較術(shù)前均呈現(xiàn)不同程度的表達(dá)上升。而排斥組患者出現(xiàn)排斥反應(yīng)時其ILT