細(xì)菌熒光素酶-NADH：FMN氧化還原酶體系與IMS聯(lián)用進(jìn)行水產(chǎn)品致病菌的快速檢測(cè).pdf

1、致病菌污染可導(dǎo)致多種食源性疾病的發(fā)生，嚴(yán)重危害人類健康，是影響食品安全的首要因素。研究和發(fā)展新型、快速、靈敏、特異的致病菌檢測(cè)技術(shù)，己成為保證食品安全的關(guān)鍵。本論文基于生物發(fā)光的原理，借助于免疫磁珠分選(IMS)技術(shù)平臺(tái)，建立了適用于水產(chǎn)品致病菌檢測(cè)的細(xì)菌熒光素酶-NADH：FMN氧化還原酶體系。該雙酶體系通過(guò)檢測(cè)細(xì)菌胞內(nèi)NADH達(dá)到檢測(cè)致病菌數(shù)量的目的。應(yīng)用該體系對(duì)水產(chǎn)品中單增李斯特菌、鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行了快速識(shí)別檢測(cè)。 第一

2、、本論文對(duì)細(xì)菌熒光素酶-NADH: FMN氧化還原酶體系進(jìn)行了優(yōu)化，建立了適合測(cè)定NADH含量的雙酶體系。應(yīng)用該體系檢測(cè)NADH具有高靈敏性，NADH的檢測(cè)限為1×10-10 mol/L，遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)方法——紫外法和熒光法NADH檢測(cè)限(1x10-5mol/L，1×10-8mol/L)。 第二、選用免疫磁珠分選作為樣品的前處理方法，可以解決細(xì)菌熒光素酶-NADH:FMN氧化還原酶體外發(fā)光體系無(wú)法對(duì)不同菌種胞內(nèi)NADH進(jìn)行特異識(shí)別的

3、問(wèn)題，從而達(dá)到特異檢測(cè)目的菌的目的。本論文評(píng)價(jià)了商品化Dynabeads anti-Listeria和Dynabeads anti-Salmonella對(duì)致病菌免疫分選效果，確定了免疫磁珠分選法的檢測(cè)限——單增李斯特菌的檢測(cè)限為4×102cfu/mL、鼠傷寒沙門氏菌的檢測(cè)限為5cfu/mL；分析了免疫磁珠的特異性，研究了競(jìng)爭(zhēng)菌對(duì)免疫磁珠分選目的菌的影響；對(duì)被高濃度致病菌污染(目的菌)的樣品進(jìn)行免疫磁珠分選；通過(guò)改變磁珠工作體積(由20μ

4、L優(yōu)化為60μL)提高了目的菌與免疫磁珠的結(jié)合率，以滿足雙酶體系檢測(cè)致病菌菌數(shù)的靈敏性要求。 自行制備了霍亂弧菌免疫磁珠，并進(jìn)行了性能分析。為利用細(xì)菌熒光素酶-NADH：FMN氧化還原酶體系檢測(cè)水產(chǎn)品中更多種類致病菌打下基礎(chǔ)。 第三、對(duì)細(xì)菌胞內(nèi)NADH的提取作了探討，確定熱Tris-HCl法作為菌體胞內(nèi)NADH的提取方法。利用雙酶體系對(duì)單增李斯特菌和鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行測(cè)定，確定兩種菌單位菌體胞內(nèi)NADH含量分別為2.38

5、×10-17mol/cell，2.78×10-16mol/cell，為今后的定量生物發(fā)光傳感器打好基礎(chǔ)。 第四、細(xì)菌熒光素酶-NADH：FMN氧化還原酶體系與IMS聯(lián)用對(duì)純培養(yǎng)和水產(chǎn)品樣品中的單增李斯特菌和鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)。兩種致病菌的菌數(shù)在108～1010cfu/mL(g)間與雙酶體系的發(fā)光強(qiáng)度呈一定的線性關(guān)系。在不增菌的情況下，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程在1h內(nèi)完成，檢測(cè)限為108cfu/ml(g)。體系的靈敏性有待進(jìn)—步的提高。

6、 第五、對(duì)單增李斯特菌、鼠傷寒沙門氏菌的前增菌做了初步研究，以提高雙酶體系靈敏性。選擇EB增菌液及亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)分別對(duì)單增李斯特菌和鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行增菌，得到以下結(jié)論：EB增菌液對(duì)非單增李斯特菌有強(qiáng)烈的抑制作用，單增李斯特菌污染量為1 cfu/g的樣品經(jīng)過(guò)32h培養(yǎng)可滿足雙酶體系的靈敏性；鼠傷寒沙門氏菌污染量為1 cfu/g的樣品經(jīng)過(guò)12 h培養(yǎng)也可滿足雙酶體系的靈敏性。在增菌的情況下，34h、14h內(nèi)可完成單增李