谷氨酸受體NMDAR1在成人心臟中的分布及其法醫(yī)學(xué)意義.pdf

1、谷氨酸(Glutamates，Glus)是自然界中廣泛存在的一種興奮性氨基酸，在人類食物中的含量豐富。谷氨酸也是大腦中最豐富的氨基酸，并且是脊椎動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳導(dǎo)興奮性沖動(dòng)的重要神經(jīng)遞質(zhì)。在生理濃度時(shí)，谷氨酸通過體內(nèi)的谷氨酸受體(Glutamate receptors，GluRs)調(diào)節(jié)許多生理反應(yīng)，包括感覺傳導(dǎo)通路、高級(jí)腦活動(dòng)(如學(xué)習(xí)、記憶、運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知和發(fā)育等)；但在較高濃度時(shí)，谷氨酸則充當(dāng)一種神經(jīng)毒素，可誘導(dǎo)嚴(yán)重的神經(jīng)損害。因此，谷

2、氨酸可認(rèn)為是一把“雙刃劍”——由神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)變成神經(jīng)毒素。 谷氨酸受體有兩種類型：促離子型谷氨酸受體(ionotropic GluRs，iGluRs)和促代謝型谷氨酸受體(metabotropic GluRs，mGluRs)。iGluRs是陽離子配體門控通道，調(diào)節(jié)快速突觸信號(hào)傳導(dǎo)，根據(jù)它們序列的相似性、電生理特性及與選擇性拮抗劑親和力不同分為三個(gè)亞型，即N-methyl-D-aspartate(NMDA)受體，α-amino-3-

3、hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid(AMPA)受體和紅藻氨酸鹽(kanic acid，Ka)受體。NMDA受體由不同亞型組成，主要有NR1、NR2A、NR2B、NR2C、NR2D、NR3A和NR3B。 NR1亞型是NMDA受體的主要亞型，是離子通道的重要功能單位。兩個(gè)NR1亞型組成的同源寡聚體形成一個(gè)完整的功能通道，可以透過鈉離子、鉀離子、銫離子和其他陽離子，但它的主要功能是轉(zhuǎn)

4、送鈣離子。興奮性氨基酸受體的作用和Ca2+/Na+內(nèi)流有關(guān)，離子流的變化可產(chǎn)生一個(gè)沿細(xì)胞膜傳導(dǎo)的動(dòng)作電位。 心臟有豐富的神經(jīng)支配和特殊的傳導(dǎo)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)快傳導(dǎo)和心臟節(jié)律。心血管系統(tǒng)功能紊亂與軟骨藻酸和食物中其他興奮劑如味精等有關(guān)，這表明心臟可能是這些物質(zhì)的一個(gè)靶器官。另外，由各種神經(jīng)毒素包括興奮性氨基酸的毒性效果產(chǎn)生的神經(jīng)癥狀和臨床表現(xiàn)提示這些毒素參與了心血管功能紊亂。觀察谷氨酸受體在心臟中的表達(dá)情況是評(píng)價(jià)這些物質(zhì)作用的第一步。本

5、實(shí)驗(yàn)擬在前人動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用westem blot和免疫組化的方法探索谷氨酸受體一NMDAR1在成人心臟中是否有表達(dá)及其分布情況；如果成人心臟中存在NMDAR1，將進(jìn)一步觀察青壯年猝死綜合征死者心臟中NMDAR1表達(dá)，并與正常心臟中的表達(dá)情況進(jìn)行比較，探討其法醫(yī)學(xué)意義，以期為青壯年猝死案件的死因鑒定提供新的思路。材料與方法本實(shí)驗(yàn)按照設(shè)計(jì)分為兩部分。 1、NMDAR1在成人心臟中的表達(dá)分布研究： 實(shí)驗(yàn)組為人體心臟，陽性

6、對(duì)照組為人體腦組織，檢材來自中山大學(xué)法醫(yī)鑒定中心的高墜案例。按照中山大學(xué)法醫(yī)系宋一璇等創(chuàng)建的心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)取材方法，切取竇房結(jié)、房室結(jié)、房室束及左右束支等組織；常規(guī)取左、右心室??；常規(guī)取大腦額部組織作為陽性對(duì)照。所取標(biāo)本一式兩份，一份置于液氮中保存，然后提取蛋白質(zhì)，進(jìn)行westem blot實(shí)驗(yàn)，用于檢測(cè)NMDARl蛋白在心臟中的表達(dá)；一份置于10﹪福爾馬林固定，而后石蠟包埋、切片，片厚4μm，分別進(jìn)行HE染色和NMDAR1免疫組織化學(xué)染

7、色，確定NMDAR1在心臟中的分布情況。 2、NMDAR1在青壯年猝死綜合癥案件中的應(yīng)用研究： 23例人體心臟標(biāo)本來源于2004年～2006年中山大學(xué)法醫(yī)鑒定中心病理檢案中資料完整的案例(存檔蠟塊)，分為2組： 1) 正常人體心臟對(duì)照組：12例，交通事故即時(shí)死亡8例，高墜致死4例，經(jīng)系統(tǒng)尸檢及常規(guī)組織學(xué)檢查，心臟未見明顯病理改變。 2) 青壯年猝死綜合征組：心肌標(biāo)本11例，死亡前無明顯誘因，死后經(jīng)系統(tǒng)尸檢

8、及常規(guī)組織學(xué)檢查沒有發(fā)現(xiàn)致死性病變。 以上2組年齡、心臟重量、以及死亡至尸檢的時(shí)間經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。傳導(dǎo)系統(tǒng)組織參照宋一璇等的取材方法進(jìn)行，切取腦組織、心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)(竇房結(jié)、房室結(jié)、房室束及左右束支)及左、右心室心肌分別進(jìn)行HE染色和NMDARl免疫組織化學(xué)染色。對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和計(jì)算機(jī)圖像分析，所得數(shù)據(jù)輸入Microsoft Excel數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用SPSS 13.0 for windows對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

9、 1．常規(guī)HE染色結(jié)果NMDAR1在成人心臟中的表達(dá)分布研究中陽性對(duì)照組的大腦皮質(zhì)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞核較大，圓形，位于胞體中央；可見少量膠質(zhì)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組左、右心室及室間隔心肌細(xì)胞橫紋清晰，細(xì)胞核致密呈藍(lán)色，部分心肌纖維斷裂或呈波浪狀排列；竇房結(jié)結(jié)細(xì)胞和結(jié)締組織沿竇房結(jié)動(dòng)脈排列，相互交織成網(wǎng)狀，形似迷路；在中心纖維體旁房室結(jié)結(jié)細(xì)胞呈波浪狀排列、較細(xì)；希氏束周圍有纖維組織包裹，呈長(zhǎng)橢圓形；束支行走于心內(nèi)膜下，較細(xì)、呈彎曲狀，周圍有網(wǎng)狀纖維

10、。 NMDAR1在青壯年猝死綜合癥案件中的應(yīng)用研究中正常人體心臟對(duì)照組心肌細(xì)胞橫紋清晰，偶見心肌細(xì)胞輕度水腫和心肌纖維斷裂，冠狀動(dòng)脈未見異常，部分傳導(dǎo)系統(tǒng)輕度脂肪浸潤(rùn)。青壯年猝死綜合征組冠狀動(dòng)脈檢查除2例有左主干I級(jí)粥樣硬化外，其余均通暢；心肌纖維部分?jǐn)嗔?，橫紋尚清，散在嗜酸性增強(qiáng)，未見梗死灶。傳導(dǎo)系統(tǒng)除2例輕度脂肪浸潤(rùn)，其余未見異常。 2．免疫組織化學(xué)染色大腦皮質(zhì)神經(jīng)元、心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)(竇房結(jié)、房室結(jié)、希氏束及其束支)的

11、心肌細(xì)胞中可見NMDAR1陽性表達(dá)，位于細(xì)胞漿中。而在左、右心室肌中均未見明顯陽性表達(dá)。陰性對(duì)照組未見陽性表達(dá)。 3．Western Blot結(jié)果在NMDAR-1在成人心臟中的表達(dá)分布研究中發(fā)現(xiàn)NMDAR1蛋白在陽性對(duì)照組的大腦組織和實(shí)驗(yàn)組的竇房結(jié)、房室結(jié)、左右心室肌中均有表達(dá)，蛋白條帶位于103kD處。NMDAR1蛋白在腦組織中表達(dá)最強(qiáng)，其次為竇房結(jié)和房室結(jié)，而左、右心室肌中蛋白表達(dá)非常弱。 4．計(jì)算機(jī)圖像分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)

12、分析結(jié)果正常人體心臟對(duì)照組竇房結(jié)中NMDAR1表達(dá)的陽性單位是：16.471±1.409，青壯年猝死綜合征組竇房結(jié)陽性單位是：18.170±1.762，t檢驗(yàn)結(jié)果：t=-2.518，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。正常人體心臟對(duì)照組房室結(jié)中NMDAR1表達(dá)的陽性單位是：10.721±1.353，青壯年猝死綜合征組竇房結(jié)陽性單位是：12.065±1.185，t檢驗(yàn)結(jié)果：t=-2.523，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。正常人體心臟對(duì)照組希氏束中N

13、MDAR1表達(dá)的陽性單位是：5.977±1.050，青壯年猝死綜合征組希氏束陽性單位是：6.498±0.974，t檢驗(yàn)結(jié)果：t=-1.1103，P>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論: 1、成人心臟中存在離子型谷氨酸受體亞型-NMDAR1。 2、NMDAR1主要分布在心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)(竇房結(jié)、房室結(jié)、希氏束和左右束支)；NMDAR1在心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)的特異性分布表明NMDAR1可能在心臟電生理和病理生理中起作用。 3