應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)研究小鼠急、慢性肝損傷.pdf

1、目前酒精性肝損傷的發(fā)病率呈逐年上漲趨勢(shì)，對(duì)酒精性肝病的診斷需要多種指標(biāo)相互驗(yàn)證。本文擬探討若干基因作為肝損傷分子生物學(xué)檢測(cè)候選指標(biāo)的可行性。首先取小鼠120只隨機(jī)分成正常組和肝損傷模型組，連續(xù)給與模型組小鼠灌喂酒精。于第6周、第12周檢測(cè)到模型組小鼠血清ALT活性有所升高，TP、ALB含量顯著下降，而GLB含量無明顯變化；肝組織病理切片顯示肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，有脂肪變性以及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等特征。提示酒精誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型成立。然后分別提取

2、模型組和正常組小鼠肝組織RNA，經(jīng)SMART技術(shù)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。在正常組和模型組cDNA中，用PCR擴(kuò)增CD14、LBP、MCP-1、ICAM-1、IL-10、OPN6個(gè)基因片斷。結(jié)果顯示以上基因在模型組中的表達(dá)均顯著高于正常組；且隨損傷程度加深，LBP、MCP-1、ICAM-1、IL-10表達(dá)量亦呈增加趨勢(shì)。因此，這些基因可作為用分子生物學(xué)方法檢測(cè)酒精性肝損傷的候選指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)為在分子水平上進(jìn)行肝損傷的檢測(cè)提供理論依據(jù)。 用

3、SSH方法構(gòu)建CCl4誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷組織與正常肝組織差異表達(dá)基因的cDNA文庫 本文利用抑制性消減雜交方法構(gòu)建了CCl4誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷組織與正常肝組織差異表達(dá)基因的cDNA文庫。首先建立CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷的小鼠模型：小鼠腹腔注射40％CCl4：花生油溶液(40：60)，16h后檢測(cè)到血清中AST、ALT活性均明顯升高，TP、ALB含量顯著下降，GLB含量無明顯變化；病理切片顯示肝細(xì)胞有氣球樣變性、小葉結(jié)構(gòu)模糊、血管充

4、血、部分淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。提示CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠模型成立。然后我們?cè)谠撃Ｐ椭袑ふ遗c正常鼠肝組織差異表達(dá)的基因并構(gòu)建消減cDNA文庫：(1)分別提取肝組織mRNA，用SMART技術(shù)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，經(jīng)過酶切、接頭連接、兩輪消減雜交及兩輪抑制性PCR，使得差異表達(dá)的cDNA片段得以富集；(2)用T/A克隆構(gòu)建差異表達(dá)基因的cDNA消減文庫；(3)隨機(jī)挑選60個(gè)陽性克隆進(jìn)行PCR鑒定，其中有55個(gè)克隆有200-750bp的插入片斷，證實(shí)