神經(jīng)突起誘向因子（Netrin-4）受體的初步研究.pdf

1、目的：神經(jīng)突起生長誘向因子Netrin是一種分泌蛋白，在神經(jīng)發(fā)育所需的軸突誘向及細胞遷移中發(fā)揮雙重誘向功能——吸引或排斥，主要依賴于生長錐所表達的不同受體結直腸癌缺失蛋白(DCC)或UNC5同源物(UNC5H)，從而傳遞不同信息。本課題組在從事4～6月孕齡人胎肝cDNA文庫大規(guī)模測序中發(fā)現(xiàn)一種新基因，經(jīng)生物信息學分析確認為Netrin家族成員，即Netrin-4[1]，已有研究證明Netrin-4具有軸突誘向功能，但尚未明確其受體及信號

2、轉導通路。本研究探討了神經(jīng)突起生長誘向因子Netrin-4的受體以及Netrin-1已知受體DCC和UNC5H1作為Netrin-4受體的可能性，為從蛋白水平研究其信號轉導機制及生物學功能提供依據(jù)。 方法：構建真核表達載體AP4-Netrin-4、AP4-Netrin-1，轉染COS7細胞以獲得含有堿性磷酸酶(AP)的融合蛋白。改良Koh法分離、原代培養(yǎng)出生12h內清潔級Wistar乳鼠的嗅球及皮層神經(jīng)元，采用免疫細胞化學方法

3、鑒定其純度。AP4-Netrin-4融合蛋白與原代培養(yǎng)第7d的神經(jīng)元孵育，以親和細胞化學法及堿性磷酸酶原位顯色間接反映Netrin4受體在神經(jīng)元的定位(因為該融合蛋白能和Netrin-4受體在細胞表面發(fā)生親和反應，從而可用堿性磷酸酶顯色進行檢測)。以AP4-Netrin-4為配體，以編碼DCC和UNC5H1的真核表達載體轉染COS7細胞為對象，采用親和細胞化學技術檢測DCC、UNC5H1作為Netrin-4受體的可能性。再以原代培養(yǎng)神經(jīng)

4、元為對象，檢測受體結合動力學、受體競爭結合動力學。 結果：原代培養(yǎng)第7d的嗅球及皮層神經(jīng)元胞體飽滿，突起長并交織成網(wǎng)狀；免疫細胞化學染色見神經(jīng)絲蛋白(neurofilament)在神經(jīng)元胞體及突起中表達；嗅球及皮層神經(jīng)元的細胞膜上均有Netrin-4受體表達。轉染已知Netrin-1受體DCC和UNC5H1的COS7細胞既能與Netrin-1，也能與Netrin-4結合；受體結合飽和實驗顯示配體與受體呈快速結合(15min達高