軸突導(dǎo)向因子netrin-1及其受體家族在角膜血管新生中的導(dǎo)向作用.pdf

1、目的：研究神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子netrin-1 及其受體UNC5B 在體外微血管模型的作用。檢測netrin-1 受體在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）與新生血管化角膜中的表達(dá)差異。分析軸突導(dǎo)向因子netrin-1對(duì)角膜新生血管（corneal neovascularization，CNV）的作用。
　　 方法：
　　 1. 體外實(shí)驗(yàn)：原代培養(yǎng)HU

2、VECs，檢測不同濃度（10ng/ml-5000ng/ml）netrin-1作用72 小時(shí)后對(duì)HUVECs增殖活性（CCK-8法）與遷移能力（Transwell 小室）的影響。構(gòu)建體外二維微血管模型，光鏡下觀察不同濃度netrin-1對(duì)體外微血管管腔形成的影響。采用RT-PCR檢測HUVECs中netrin-1所有已知受體，包括UNC5A、UNC5B、UNC5C、UNC5D、DCC 及neogenin 共6種受體表達(dá)情況。構(gòu)建UNC5B

3、shRNA 重組質(zhì)粒，通過脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染HUVECs，檢測不同濃度（10ng ng/ml-5000ng/ml）netrin-1作用72 小時(shí)后對(duì)對(duì)UNC5B 沉默后HUVECs增殖活性與遷移能力的影響。光鏡下觀察不同濃度netrin-1對(duì)UNC5B 沉默后體外二維微血管模型中管腔形成的影響。
　　 2. 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：60只SD大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)均分成A、B、C、D、E和F組，每組10只鼠（10

4、只眼）。采用角膜微囊袋法制作角膜新生血管模型，其中A、B、C、D 及E組除植入明膠海綿+瓊脂糖膠丸外分別再加入堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）（50ng/ul）、netrin-1（100ug/ml）、bFGF+netrin-1（100ug/ml）、netrin-1（5000ug/ml）、bFGF+netrin-1（5000ug/ml），對(duì)照組（F組）只含明膠海綿+瓊脂糖膠丸

5、。植入藥丸后每日裂隙燈顯微鏡下觀察CNV的生長情況，并照相分析。在造模后7d和21d 每組各處死5只鼠，取全角膜作病理學(xué)分析。對(duì)于b-FGF誘導(dǎo)的大鼠角膜新生血管模型，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測新生血管化角膜與正常角膜中UNC5A、UNC5B、UNC5C、UNC5D、DCC 及neogenin 共6種netrin-1 已知所有受體表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1. 體外實(shí)驗(yàn)：Netrin-1 濃度低于500ng/ml

6、時(shí)，促進(jìn)HUVECs的增殖和遷移；而netrin-1濃度在1000 ng/ml-5000ng/ml時(shí)，抑制HUVECs的增殖和遷移。其中netrin-1為50ng/ml時(shí)，HUVECs的增殖能力最強(qiáng)；netrin-1 濃度為100ng/ml時(shí)，HUVECs的遷移能力最強(qiáng)。體外微血管模型顯示在濃度低于500ng/ml時(shí)，netrin-1對(duì)于血管腔形成沒有影響，而當(dāng)濃度為1000ng/ml-5000ng/ml時(shí)，netrin-1 抑制血管腔

7、的形成，且抑制作用呈劑量依賴性。HUNECs中netrin-1 受體家族只有UNC5B 一種受體表達(dá)。經(jīng)酶切和測序鑒定，本課題構(gòu)建了UNC5B特異性shRNA的重組質(zhì)粒，并成功轉(zhuǎn)染HUVECs。UNC5B 干擾組HUVECs的增殖能力比對(duì)照組增強(qiáng)（P<0.05)。UNC5B 干擾組netrin-1 使HUVECs的增殖與遷移能力增強(qiáng)，而不表現(xiàn)出抑制作用。體外血管模型中，靶向干擾UNC5B基因后，無論netrin-1 濃度多少，其對(duì)血管腔

8、的抑制作用均消失。
　　 2. 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：角膜微囊袋法新生血管模型顯示實(shí)驗(yàn)組A 在4d 左右可見新生血管從角膜緣向植入物成束局限生長，7d 左右達(dá)到高峰，3 周左右完全消退。7 d時(shí)各組新生血管面積比較，B組面積與A組相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。C組顯著高于A、B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。D、E、F組顯著低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。大鼠角膜中netrin-1 受體家族中只有UNC5B和Ne

9、ogenin兩種受體表達(dá)，其中正常角膜中UNC5B的表達(dá)低于Neogenin。新生血管化角膜中UNC5B的表達(dá)高于Neogenin。
　　 結(jié)論：Netrin-1對(duì)體外微血管管腔形成具有促進(jìn)和抑制的雙重調(diào)控作用，表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)而高濃度抑制。HUVECs中netrin-1 受體家族只有UNC5B 一種受體表達(dá)。
　　 RNA干擾實(shí)驗(yàn)顯示UNC5B 在導(dǎo)向血管生長中是一種抑制性受體，沉默UNC5B基因后促進(jìn)HUVECs增值