可吸收生物材料復(fù)合他克莫司及NETRIN-1因子制備軸突導(dǎo)向神經(jīng)鞘管的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、周?chē)窠?jīng)損傷是臨床上常見(jiàn)的疾病，常由過(guò)度牽拉、切割、壓迫、火器、電燒傷及放射性燒傷和醫(yī)源性損傷造成。損傷后如無(wú)法給予及時(shí)有效的修復(fù)，神經(jīng)突觸纖維化將造成神經(jīng)和肌肉的永久性功能性障礙，對(duì)日后的康復(fù)及生活造成不良的影響。
　　周?chē)窠?jīng)由于其特殊的結(jié)構(gòu)和復(fù)雜的細(xì)胞生理，受到損傷后難以快速有效的自我恢復(fù)，臨床上即使經(jīng)過(guò)一段時(shí)間治療后，仍存在一定程度的神經(jīng)功能缺失、神經(jīng)痛等難以解決的問(wèn)題，所以周?chē)窠?jīng)損傷后的修復(fù)一直是基礎(chǔ)和臨床科研的重點(diǎn)和

2、熱點(diǎn)。
　　現(xiàn)階段臨床上對(duì)于神經(jīng)損傷的治療多采用神經(jīng)直接縫合或自體神經(jīng)移植、藥物保護(hù)及促進(jìn)軸突再生的方法進(jìn)行治療，臨床結(jié)果差強(qiáng)人意。對(duì)神經(jīng)損傷的動(dòng)物模型進(jìn)行組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致周?chē)窠?jīng)縫合后療效不佳的原因主要有以下幾個(gè)方面:(1)神經(jīng)吻合后斷端扭曲;(2)吻合口瘢痕組織的侵入;(3)神經(jīng)的無(wú)效再生（即近端的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維長(zhǎng)入遠(yuǎn)端的感覺(jué)神經(jīng)纖維鞘內(nèi)，或近端的感覺(jué)神經(jīng)纖維長(zhǎng)入遠(yuǎn)端的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維鞘內(nèi)）;(4)神經(jīng)再生速度遲緩，神經(jīng)肌肉突觸

3、纖維化等原因。現(xiàn)階段無(wú)論是采用外膜縫合或者是束膜縫合方法均無(wú)法完全避免上述問(wèn)題。如何使損傷后的周?chē)窠?jīng)組織及時(shí)有效的恢復(fù)最佳功能，仍是目前困擾醫(yī)學(xué)工作者的一大難題。
　　組織工程技術(shù)（Tissue Engineering）作為一種跨越生命科學(xué)和工程科學(xué)的交叉學(xué)科，近些年來(lái)取得了長(zhǎng)足的發(fā)展和應(yīng)用。其基本理論是構(gòu)建一種仿生物的組織工程框架，可以為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供支撐，隨著組織和器官的逐步恢復(fù)，支架本身的材料可以通過(guò)自身的降解被自身的組織

4、所代替，其降解的產(chǎn)物可以通過(guò)代謝途徑轉(zhuǎn)化成對(duì)人體無(wú)害的分子排出體外。并且，隨著人們對(duì)這項(xiàng)技術(shù)認(rèn)識(shí)的逐步加深，通過(guò)在支架上輔以特殊的有針對(duì)性的細(xì)胞因子，可以有效的加快損傷組織的再生與恢復(fù)。同時(shí)人們對(duì)于利用這項(xiàng)技術(shù)修復(fù)周?chē)窠?jīng)損傷提出了許多先進(jìn)的觀點(diǎn)。理想的神經(jīng)修復(fù)鞘管應(yīng)具有以下的結(jié)構(gòu)和組成:a支架材料要有仿生物學(xué)設(shè)計(jì)，可以提供良好的力學(xué)性能和可塑性，同時(shí)，管壁應(yīng)表現(xiàn)為半透膜性質(zhì)，以保證營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交換和組織再生代謝產(chǎn)物的排出，同時(shí)可以阻止纖

5、維瘢痕的長(zhǎng)入;b加入神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，并能有效控制其釋放;c鞘管降解的時(shí)間應(yīng)能充分滿(mǎn)足神經(jīng)生長(zhǎng)所需要的時(shí)間，否則未等神經(jīng)完全恢復(fù)，鞘管已經(jīng)降解，起不到相應(yīng)的保護(hù)作用。
　　本研究首次嘗試通過(guò)靜電紡絲技術(shù)構(gòu)建了以聚乳酸-羥基乙酸共聚物/殼聚糖為主體的復(fù)合了他克莫司(Tacrolimus，F(xiàn)K506)以及Netrin-1因子的軸突導(dǎo)向神經(jīng)鞘管。為了達(dá)到上述要求，本試驗(yàn)進(jìn)行了下述方面的研究:(1)利用微流控技術(shù)構(gòu)建高通量藥物篩選芯片，明確局

6、部使用FK506以及Netrin-1神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子的最佳濃度。(2)殼聚糖復(fù)合FK506及Netrin-1神經(jīng)鞘管的制備與性能修飾。(3)檢測(cè)神經(jīng)鞘管的理化性質(zhì)以及生物安全性。
　　實(shí)驗(yàn)一使用微流控芯片篩選局部應(yīng)用FK506及Netrin-1的最佳有效濃度的研究目的:設(shè)計(jì)并制作微流控芯片，篩選局部應(yīng)用FK506及Netrin-1的最佳有效濃度。方法:基于雷諾效應(yīng)原理，設(shè)計(jì)出包含濃度梯度生成器以及細(xì)胞培養(yǎng)室的微流控芯片，利用熒光成

7、像驗(yàn)證芯片在細(xì)胞水平篩查藥物對(duì)神經(jīng)再生作用的能力。分離培養(yǎng)、擴(kuò)增大鼠的雪旺細(xì)胞以及背根神經(jīng)元細(xì)胞，將細(xì)胞接種于芯片后，使用CCK-8試劑盒檢測(cè)雪旺細(xì)胞增殖水平，同時(shí)測(cè)量背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突生長(zhǎng)長(zhǎng)度。通過(guò)液相質(zhì)譜色譜分析藥物的有效濃度。并于96孔板中重復(fù)不同濃度下的細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)微流控芯片結(jié)果的可靠性。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建了微流控芯片，通過(guò)熒光強(qiáng)度驗(yàn)證了芯片生成濃度梯度的可靠性。利用芯片獲得FK506局部最佳濃度為1.786±0.

8、014ng/ml; Netrin-1最佳局部濃度為51.42±0.14 ng/ml。
　　結(jié)論:1.制作的微流控芯片可以有效形成藥物的作用濃度梯度;2.篩選出FK506神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)最佳濃度為1.786±0.014ng/ml; Netrin-1最佳濃度為51.42±0.14 ng/ml。
　　實(shí)驗(yàn)二靜電紡絲技術(shù)構(gòu)建聚乳酸-羥基乙酸共聚物/殼聚糖復(fù)合他克莫司及Netrin-1軸突導(dǎo)向神經(jīng)鞘管的研究目的:1.構(gòu)建單電場(chǎng)雙噴頭靜電紡

9、絲設(shè)備。2.制備FK506及Netrin-1軸突導(dǎo)向神經(jīng)鞘管。3.對(duì)鞘管的結(jié)構(gòu)以及基本理化性質(zhì)進(jìn)行評(píng)估。
　　方法:按照實(shí)驗(yàn)要求搭建靜電紡絲設(shè)備，并對(duì)設(shè)備進(jìn)行改造，使其可以滿(mǎn)足雙噴頭共紡的需求。使用單電場(chǎng)雙噴頭技術(shù)，對(duì)聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolicacid)，PLGA)和殼聚糖/FK506/Netrin-1共混溶液進(jìn)行共紡，并不斷調(diào)整各參數(shù)配比，獲得復(fù)合的神經(jīng)鞘管。對(duì)鞘管進(jìn)行掃描電鏡觀察，力

10、學(xué)機(jī)檢測(cè)鞘管的彈性模量，并對(duì)鞘管的基本理化性質(zhì)做出測(cè)定。
　　結(jié)果:構(gòu)建并改良了靜電紡絲設(shè)備。獲得了滿(mǎn)足局部最佳濃度的FK506及Netrin-1因子的電紡溶液配比，并制備了軸突導(dǎo)向神經(jīng)鞘管。神經(jīng)鞘管具有納米纖維結(jié)構(gòu)，復(fù)合鞘管的PLGA纖維平均直徑為197±9.9nm，殼聚糖纖維為105±4.3nm，孔隙率為76.25％，吸水率為11.2％，干燥狀態(tài)下彈性模量為1.525±0.116，濕潤(rùn)狀態(tài)下彈性模量為0.819±0.125。鞘

11、管體外降解10周后，質(zhì)量降解為0.138g，降解率47.26％。FK506以及Netrin-1因子可以在45日內(nèi)提供最佳有效濃度。
　　結(jié)論:構(gòu)建的單電場(chǎng)雙噴頭靜電紡絲設(shè)備符合實(shí)驗(yàn)要求。獲得了FK506及Netrin-1因子的電紡溶液配比，制備了PLGA/殼聚糖復(fù)合FK506及Netrin-1軸突導(dǎo)向神經(jīng)鞘管。鞘管具有納米級(jí)纖維，良好的親水性和理化特點(diǎn)。
　　實(shí)驗(yàn)三 PLGA/殼聚糖復(fù)合FK506及Netrin-1軸突導(dǎo)向神

12、經(jīng)鞘管生物安全性的研究目的:對(duì)PLGA/殼聚糖復(fù)合FK506及Netrin-1軸突導(dǎo)向神經(jīng)鞘管生物安全性進(jìn)行檢測(cè)和評(píng)價(jià)。
　　方法:通過(guò)大鼠體內(nèi)注射浸提液、皮下刺激實(shí)驗(yàn)、P(II)測(cè)定、溶血試驗(yàn)、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)以及AO-PI染色評(píng)價(jià)鞘管的體外生物安全性。同時(shí)，將PKH26染色的大鼠BMSC/鞘管復(fù)合物植入裸鼠體內(nèi)，利用活體熒光成像系統(tǒng)檢測(cè)支架在體內(nèi)降解過(guò)程中的生物安全型，并對(duì)植入SD大鼠體內(nèi)的鞘管進(jìn)行HE染色，評(píng)價(jià)鞘管周?chē)w維囊厚度

13、、炎性細(xì)胞數(shù)量和8周內(nèi)質(zhì)量損失。
　　結(jié)果:各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)死亡，全身急性毒性反應(yīng)陰性，P(II)為0;溶血率為0.058％，無(wú)溶血作用;細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、AO-PI染色、體內(nèi)植入鞘管及其降解產(chǎn)物均未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性。鞘管纖維囊厚度以及周?chē)装Y細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)間降低，且降解周期內(nèi)炎性細(xì)胞及纖維細(xì)胞無(wú)法透過(guò)管壁侵入管腔。
　　結(jié)論:采用PLGA/殼聚糖復(fù)合FK506及Netrin-1制備的神經(jīng)修復(fù)鞘管以及其降解產(chǎn)物具有良好的生物安全性和組