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文檔簡介
1、胎盤是母體與胎兒之間進行氣體交換、營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)、排除代謝產(chǎn)物的器官。在妊娠過程中,胎盤血管承擔著胎兒全部的血供需求,對胎兒宮內(nèi)發(fā)育起著極其重要的作用。胎盤血管形成障礙可導(dǎo)致妊娠結(jié)局不良,其中包括大多數(shù)的圍生期胎兒的并發(fā)癥,如胎兒生長受限(FGR)、胎兒窘迫、早產(chǎn),以及遠期的胎兒并發(fā)癥如小腦發(fā)育不良,而且還與母體的妊娠高血壓疾病有關(guān)。因此研究胎盤血管形成無疑具有重要的意義。研究表明,血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、纖維母細胞生長因子(FGF
2、)、血管肽素(ANG)等均參與胎盤血管形成。除了這些傳統(tǒng)的因子,一些新的血管形成調(diào)節(jié)因子正在被逐步發(fā)掘。
Netrin-1是一類高度保守的層粘連蛋白相關(guān)分子,屬于netrins家族,其作為經(jīng)典的神經(jīng)導(dǎo)向因子而聞名。由于神經(jīng)和血管的生長方式十分相似,它們均是層次有序的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),并沿著相同的路線,相互依賴。因此,這使人們對netrin-1在血管中的作用產(chǎn)生濃厚興趣。研究發(fā)現(xiàn),netrin-1具有與VEGF相同的促血管生成作用,
3、是一種正向血管生成調(diào)節(jié)因子。但也有不少研究顯示了不同的結(jié)果,認為在血管生長和形成的過程中,netrin-1是作為一種排斥信號存在的。因此,netrin-1在血管形成中的作用尚不明確。而且,在母體中胎盤是唯一無神經(jīng)分布但富含血管的組織,netrin-1是否參與胎盤血管的形成和發(fā)育呢?
本研究通過細胞和分子生物學(xué)技術(shù)研究netrin-1在胎盤血管發(fā)育中的作用,為探索胎盤血管發(fā)育尋找新的研究途徑,并為增加胎盤血供提供新的理論依據(jù)
4、。
第一部分軸突導(dǎo)向因子-1在血管生成模型中的作用研究
目的:由于神經(jīng)和血管的生長發(fā)育過程有很大相似性。Netrin-1作為經(jīng)典的神經(jīng)導(dǎo)向因子,其在血管生成中具有的作用無疑令人關(guān)注。盡管有實驗證實了netrin-1促血管生成的作用,但也有不少研究顯示了相反的結(jié)果。Netrin-1在血管生成中的確切作用尚不明確,還存在不少爭論。而且這些研究大部分都集中在體外培養(yǎng)模型上。體外培養(yǎng)模型因為不能模擬體內(nèi)復(fù)雜血管生成過
5、程,有其一定的局限性。因此,本研究擬利用離體和在體血管生成模型,模擬的條件更接近體內(nèi)環(huán)境,也更為接近機體的生理狀態(tài),進一步闡明netrin-1與血管生成之間的聯(lián)系。
方法:
1.離體大鼠動脈環(huán)實驗:取SD大鼠,無菌條件下切取胸主動脈,立即放入DMEM液中清洗,在解剖顯微鏡觀察下,脈管外纖維和脂肪組織。切取1mm長的動脈環(huán),用DMEM液沖洗數(shù)遍。在孔板內(nèi)加入Matrigel做鋪墊。再加入正在凝結(jié)的Matrige
6、l,立即放入動脈環(huán),37℃內(nèi)放置30 min,后分別加入含10、50、100 ng/mL netrin-1的無血清培養(yǎng)液,37 ℃、5% CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng),倒置顯微鏡下觀察計數(shù)微血管樣結(jié)構(gòu)的數(shù)量。
2.活體內(nèi)Matrigel plug實驗:取雄性C57/BL6小鼠,分為對照組和netrin-1組,分別沿腹膜正中線注射50 U/mL肝素和0.5ml的Matrigel(對照組含PBS,netrin-1組含50ng/mL ne
7、trin-1)。7天后處死小鼠,取出Matrigel plug,照相。分析Matrigel plug內(nèi)的血紅素值水平。4%多聚甲醛固定、包埋、切片,采用免疫熒光染色法檢測CD34的表達。
結(jié)果:
1.離體大鼠動脈環(huán)實驗結(jié)果表明,加入10 ng/mL,50 ng/mL和100 ng/mL netrin-1各組血管生成數(shù)量發(fā)分別為186.29±35.77,291.50±52.47,267.12±44.93均多于對
8、照組56.25±10.79,差異有顯著性。其中50 ng/mL netrin-1促血管生成效應(yīng)最為顯著。
2.進一步用50 ng/mL netrin-1做活體內(nèi)Matrigel plug實驗。結(jié)果顯示,包含有netrin-1的Matrigel plug轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色,陰性對照組未見明顯變色。血紅素值分析結(jié)果顯示,含有netrin-1的Matrigel plug的血紅素值為53.4±7.3,大于對照組(5.8±0.9),差異有極
9、顯著性。用血管內(nèi)皮標記物CD34抗體行Matrigel plug切片免疫熒光染色,含有netrin-1的Matrigel plug內(nèi)可見血管樣結(jié)構(gòu),對照組中未見。
結(jié)論:Netrin-1作為一種神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子,其在離體和在體血管生成模型中均具有促血管生成效應(yīng),是一種有效的血管生成因子。
第二部分胎盤微血管內(nèi)皮細胞的分離與鑒定
目的:由于胎盤微血管內(nèi)皮細胞是構(gòu)成胎盤屏障的主要成分之一,不僅具有調(diào)
10、節(jié)血管通透性、進行物質(zhì)交換和代謝、免疫調(diào)節(jié)等相關(guān)的作用,而且還是胎盤血管形成發(fā)育以及相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。大量研究資料表明,微血管內(nèi)皮細胞不同于大血管內(nèi)皮細胞,其在許多病理生理過程中起著關(guān)鍵性的作用。采用不同器官或組織來源的微血管內(nèi)皮細胞研究相關(guān)發(fā)病機制已經(jīng)成為非常有價值的技術(shù)方法。因此,為了探討netrin-1在胎盤血管形成中的作用,本研究擬采用酶消化和不連續(xù)Percoll密度梯度離心法分離人胎盤微血管內(nèi)皮細胞。
11、方法:
1.分離人胎盤微血管內(nèi)皮細胞:無菌留取自愿人工流產(chǎn)的健康孕婦絨毛組織,用預(yù)冷的含抗生素生理鹽水沖洗兩次。留取三級絨毛或是絨毛末端。將組織剪碎經(jīng)過Ⅰ型膠原酶、Ⅱ型Dispase酶、Ⅰ型DNA酶和胰酶消化后,將所得消化液經(jīng)篩網(wǎng)過濾,收集濾液,離心,收集沉淀,用DMEM培養(yǎng)液重懸細胞,重懸液貼管壁緩慢加入25%、30%、35%不連續(xù)Percoll梯度中,離心后收集距離液面1.5-2.0 cm的白色絮狀層,加入DMEM培養(yǎng)
12、液重懸接種于培養(yǎng)瓶。
2.免疫熒光染色鑒定細胞:傳代后,制備細胞爬片,用vWF行免疫熒光染色。爬片用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定。加正常山羊血清封閉30 min,傾去。加vWF多克隆抗體,4℃孵育過夜。用FITC綠色熒光標記IgG二抗?jié)窈袃?nèi)孵育1 h,熒光顯微鏡下觀察。
3.RT-PCR鑒定細胞:根據(jù)報道,TLX1和TLX2等同源基因在胎盤微血管內(nèi)皮細胞和大血管內(nèi)皮細胞中的表達有明顯差異,這種差異可作為區(qū)分兩者的方
13、法之一。本研究利用RT-PCR檢測TLX1、TLX2 mRNA在所分離細胞中的表達情況。總RNA的提取按照Total RNA Extraction Miniprep system說明進行,用RevertAid First StrandcDNASynthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。
結(jié)果:
1.倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)細胞形態(tài)發(fā)現(xiàn),原代培養(yǎng)的胎盤微血管內(nèi)皮細胞形態(tài)和大小差異很大,可呈紡錘形、三角形或不規(guī)則形
14、等多種形態(tài)。傳代細胞初種時懸浮在培養(yǎng)液中,為明亮的圓球形,培養(yǎng)數(shù)小時后細胞即可貼壁,7天后細胞能增殖鋪滿培養(yǎng)瓶底,表現(xiàn)為明顯“鋪路石”征。
2.vWF免疫熒光檢測,結(jié)果顯示,細胞胞漿發(fā)綠色熒光,呈陽性表達。證實分離培養(yǎng)的細胞為血管內(nèi)皮細胞。
3.TLX1 mRNA在所分離的細胞中表達量(0.612±0.023)與人臍靜脈內(nèi)皮細胞(0.074±0.011)比較差異十分顯著;TLX2 mRNA在所分離的細胞中表達
15、量(0.579±0.01)與人臍靜脈內(nèi)皮細胞(0.105±0.017)比較差異顯著,證實分離的細胞為胎盤微血管內(nèi)皮細胞,而不是大血管內(nèi)皮細胞。
結(jié)論:成功分離并培養(yǎng)人胎盤微血管內(nèi)皮細胞。
第三部分軸突導(dǎo)向因子-1 對胎盤微血管內(nèi)皮細胞功能的影響
目的:Netrin-1作為第一個被鑒定出來的可溶性神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子,其在神經(jīng)導(dǎo)向和遷移形成中發(fā)揮重要作用。近年來,netrin-1在血管生長發(fā)育過程中的
16、功能備受關(guān)注。胎盤血管床作為母體和胎兒進行物質(zhì)交換的主要途徑,承擔著妊娠過程中胚胎和胎兒全部的血供需求。胎盤血管的良好發(fā)育對胚胎和胎兒宮內(nèi)發(fā)育起著極為重要的作用。前期的研究證實,netrin-1在胎盤中表達并與胎盤血管床密度呈正相關(guān)。為了進一步闡明netrin-1與胎盤血管的關(guān)系,本研究擬通過細胞實驗觀察其對胎盤微血管內(nèi)皮細胞功能的影響,以期了解netrin-1在胎盤血管形成發(fā)育過程中的作用。
方法:
1.M
17、TT:將細胞分為4組,分別為空白對照組、10 ng/mL netrin-1組,50 ng/mL netrin-1組和100 ng/mL netrin-1組,接種于48孔板內(nèi),常規(guī)培養(yǎng)24 h后每孔加入5mg/mLMTT,置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,終止培養(yǎng),每孔加入DMSO溶液150 μl,充分振蕩10 min,使結(jié)晶充分溶解,酶標儀檢測570 nm處各孔吸光值。
2.遷移試驗:于Transwell小室上層加入含n
18、etrin-1濃度分別為10、50和100 ng/mL的無血清培養(yǎng)液,同時加入0.1 ml細胞懸液,細胞濃度為3×105/mL,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h,取出Transwell小室,用棉簽擦去上室面的細胞,臺盼藍染色,顯微鏡下隨機5個視野計數(shù)下室面細胞。
3.管腔形成試驗:將細胞用DMEM培養(yǎng)液重懸,接種于包被有Matrigel(300 μl)的24孔培養(yǎng)板中,分別加入10、50和100 ng/mL net
19、rin-1,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h后倒置相差顯微鏡下觀察,以形成的管腔數(shù)量表示不同netrin-1濃度下細胞形成管腔的能力。
4.凋亡檢測:用10、50、100 ng /mL netrin-1處理細胞48 h后,將培養(yǎng)液倒入離心管,貼壁細胞用0.25%胰蛋白酶消化,制成單細胞懸液,與培養(yǎng)液中收集的懸浮細胞一起離心,棄上清,沉淀的細胞以PBS洗兩遍,最后留少許液體重懸,振蕩條件下逐漸滴加入預(yù)冷的70% 乙醇
20、5ml,4℃保存待測。測定前用PBS洗去乙醇,加入PI染液,室溫下避光染色30 min后,用流式細胞儀分析細胞的凋亡,計算各組細胞凋亡率。
結(jié)果:
1.MTT實驗結(jié)果顯示netrin-1濃度為10、50和100 ng/mL時吸光值分別為0.324±0.02、0.503±0.019和0.447±0.032,與對照組(0.203±0.012)比較,均有差異顯著性。
2.Netrin-1濃度為10、5
21、0和100 ng/mL時,遷移細胞數(shù)分別為15.6±0.5、20.8±0.9和19.6±0.2,均明顯多于對照組9.4±0.4(p<0.05或p<0.01)。
3.在10、50和100 ng/mL濃度的netrin-1作用下,實驗組細胞形成管腔的數(shù)量分別為13±1、14±2和19±2,與對照組(8±1)比較,p均<0.05。
4.流式細胞儀檢測和分析結(jié)果顯示,隨著netrin-1濃度增加,細胞凋亡率呈遞減趨勢
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