神經(jīng)軸突導(dǎo)向分子Semaphorin 5A在人胃癌中表達(dá)、作用及其分子機(jī)制的研究.pdf

1、胃癌是最常見、死亡率最高的惡性腫瘤之一。其中主要原因是胃癌的病因、發(fā)展機(jī)制還不十分了解。因此，探討胃癌的病因、發(fā)病機(jī)制和尋找新的診斷標(biāo)志物具有重大的臨床意義，并為發(fā)展新的治療策略提供有力的理論依據(jù)。
　　 Semaphorin5A是神經(jīng)軸突導(dǎo)向分子Semaphorins家族成員之一，最初是在腦神經(jīng)生長、發(fā)育過程中得到一定程度的認(rèn)識(shí)，其主要功能是起化學(xué)排斥作用，調(diào)控軸突的生長方向，引導(dǎo)軸突進(jìn)入正確的位置并建立起突觸聯(lián)系。最近的研究

2、資料表明，Semaphorin家族的部分成員在神經(jīng)系統(tǒng)以外不同組織中表達(dá)，參與了中樞神經(jīng)以外的活動(dòng)，其中最令人注意的是，他們?cè)谌祟惗喾N腫瘤組織中表達(dá)，調(diào)控腫瘤的發(fā)生和影響腫瘤形成的進(jìn)程。Semaphorin5A是Semaphorins家族成員，目前尚未有確切的研究資料表明Semaphorin5A在人類腫瘤包括胃癌中的表達(dá)及其作用。本研究擬探討Semaphorin5A在胃癌中表達(dá)及其功能和相關(guān)機(jī)制。
　　 目的：檢測Semapho

3、rin5A在胃癌中的表達(dá)，探討Semaphorin5A在胃癌發(fā)生、發(fā)展和侵襲、轉(zhuǎn)移過程中的作用和機(jī)制，為以Semaphorin5A作為靶的胃癌基因治療提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.使用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、Western blotting方法檢測Semaphorin5A在不同胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)；使用免疫組織化學(xué)、Western blotting和real-time RT-PCR方法檢測S

4、emaphorin5A在胃癌組織及其相對(duì)應(yīng)的正常胃黏膜組織中的表達(dá)并分析其與臨床病理特征之間的相關(guān)性。
　　 2.通過細(xì)菌轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、酶切、凝膠電泳、基因測序鑒定和基因重組技術(shù)等方法構(gòu)建針對(duì)Semaphorin5A的RNAi質(zhì)粒(pGen-1-SEMA5A)和陰性對(duì)照質(zhì)粒(pGen-1-scrambled)并轉(zhuǎn)染具有侵襲能力的人胃癌細(xì)胞系SGC7901細(xì)胞，經(jīng)G418篩選得到穩(wěn)定Semaphorin5A表達(dá)抑制的胃癌細(xì)胞模型

5、pGen-1-SEMA5A(si-Sema5A)。采用RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染組pGen-1-Sema5A(si-Sema5A)、對(duì)照組pGen-1-Scrambled(si-Scrambled)及未轉(zhuǎn)染組SGC7901三組細(xì)胞中Semaphorin5A的表達(dá)，以證實(shí)轉(zhuǎn)染效果。
　　 3.運(yùn)用MTT比色法、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測siRNA-Semaphorin5A對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、生長能力的影響；使用流式細(xì)胞儀和ELISA方法檢測si

6、RNA-Semaphorin5A對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響；使用黏附、運(yùn)動(dòng)、侵襲實(shí)驗(yàn)檢測siRNA-Semaphorin5A對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　 4.以si-Sema5A、SGC7901細(xì)胞為研究對(duì)象，使用ELISA、RT-PCR方法檢測siRNA-Semaphorin5A對(duì)MMP2、MMP9、uPA和pERK表達(dá)的影響；使用抗MMP2、MMP9、uPA抗體和ERKs抑制劑PD98059處理細(xì)胞，比較si-Sema5

7、A、SGC7901在處理前后侵襲能力的變化以及MMP2、MMP9、uPA在PD98059處理后的表達(dá)改變，以確定Semaphorin5A是否通過ERKs信號(hào)通路調(diào)控MMP2、MMP9、uPA的表達(dá)介導(dǎo)胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　 5.使用ELISA、RT-PCR/Western blotting方法檢測TGF-β1及其靶向基因PAI-1在si-Sema5A、SGC7901細(xì)胞中的表達(dá)水平和Smad2的磷酸化水平，為Semaphorin

8、5A是否能夠激活TGF-β1提供理論依據(jù)；將siRNA-TGF-β1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染si-Sema5A、SGC7901細(xì)胞，并比較兩種細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前后ERK磷酸化水平和侵襲能力的改變，以決定Semaphorin5A是否通過激活TGF-β1，依賴ERKs信號(hào)通路調(diào)控MMP2、MMP9、uPA的表達(dá)介導(dǎo)胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　 結(jié)果：
　　 1.Semaphorin5A在胃癌細(xì)胞系中廣泛表達(dá)，并且在具有轉(zhuǎn)移能力的胃癌細(xì)胞系(SGC790

9、1、MKN45)中的表達(dá)高于在非轉(zhuǎn)移能力的胃癌細(xì)胞系(AGS，SNU-1)(P<0.01)； Semaphorin5A在胃癌組織的表達(dá)高于對(duì)應(yīng)的正常胃粘膜組織，Semaphorin5A的表達(dá)與胃癌TMN分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分型有關(guān)，與年齡、性別、胃癌浸潤深度無關(guān)。
　　 2.siRNA-Semaphorin5A抑制胃癌細(xì)胞生長、增殖、黏附、運(yùn)動(dòng)、侵襲能力，促進(jìn)凋亡。
　　 3.與SGC7901細(xì)胞相比，MMP9、uP

10、A、pERK在si-Sema5A中表達(dá)下調(diào)，MMP2表達(dá)無變化；和si-Sema5A細(xì)胞比較，抗MMP9、uPA抗體明顯降低SGC7901細(xì)胞的侵襲能力，MEK/ERK特殊抑制劑PD98059顯著下調(diào)MMP9、uPA表達(dá)，并抑制其的侵襲能力。
　　 4.和SGC790細(xì)胞比較，TGF-β1及其靶向基因PAI-1表達(dá)水平、Smad2磷酸化水平在si-Sema5A中下調(diào)，siRNA-TGF-β1明顯降低ERK在SGC7901細(xì)胞中磷