胃癌中HLAI類分子表達(dá)下調(diào)的分子機(jī)制研究.pdf

1、HLA(human leukocyte antigen)基因控制著T細(xì)胞及NK細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中心分子的表達(dá)，腫瘤細(xì)胞常常通過不同程度下調(diào)或缺失各種HLA I類分子表達(dá)得以逃避機(jī)體免疫監(jiān)視。但是基于各種原因，胃癌中HLA I類分子表達(dá)下調(diào)的機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究闡明。
　　 本實(shí)驗(yàn)室前期對185例石蠟組織切片和50例冰凍切片免疫組織化學(xué)染色，證實(shí)胃癌中存在著高頻率的HLA I類分子的下調(diào)和丟失，在轉(zhuǎn)移癌中比原發(fā)癌更明顯，尤以H

2、LA-B/C位點(diǎn)顯著(P＜0.05rs=0.8236)。本研究將深入探討胃癌中HLA I類及相關(guān)分子表達(dá)異常的分子機(jī)制，并著重從表遺傳層次檢測胃癌中HLA I類基因啟動子區(qū)域DNA甲基化狀態(tài)，分析甲基化與HLA I類分子下調(diào)的相關(guān)性，為臨床開展胃癌免疫治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 研究結(jié)果表明：
　　 1、半定量RT-PCR及Western blot檢測20例胃癌新鮮組織標(biāo)本結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)胃癌中HLA I類及相關(guān)分子下調(diào)趨勢

3、，HLA I類分子的異常表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平上存在一致性。
　　 2、選用正常胃黏膜上皮細(xì)胞系GES-1為對照，對6株胃癌細(xì)胞系BGC-823、MCG-803、SGC-7901、AGS、MKN28、MKN45細(xì)胞表面HLA I類復(fù)合物表達(dá)檢測，結(jié)果與胃癌組織免疫組化結(jié)果一致：胃癌細(xì)胞系中HLA I類復(fù)合物普遍表達(dá)下調(diào)。半定量RT-PCR檢測所有細(xì)胞系中參與HLA I類抗原加工遞呈過程分子的表達(dá)：BGC-823和MKN28細(xì)胞

4、HLA-A分子低表達(dá)；MKN28細(xì)胞中存在蛋白酶體亞單位LMP2表達(dá)減少，LMP7表達(dá)缺失；AGS細(xì)胞中HLA-C分子低表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)AGS屬于IFN-γ不反應(yīng)型HLA-C分子下調(diào)，可能存在信號通路分子的異常；MKN28中LMP7分子的表達(dá)下調(diào)可能是其HLA I類復(fù)合物下調(diào)的主要原因。
　　 3、應(yīng)用甲基化特異性PCR(methylation specific PCR，MSP)檢測57例胃癌組織及其相應(yīng)癌旁組織中HLA I

5、類各重鏈基因啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)。發(fā)現(xiàn)胃癌組織中HLA-A、HLA-B和HLA-C的甲基化率分別為61.16％、45.61%和47.37%，與對應(yīng)癌旁組織有顯著差異(p＜0.01)。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)53.19%的HLA I類復(fù)合體下調(diào)的樣本中，至少會有一個HLA I類重鏈基因發(fā)生高甲基化(p＜0.01)。說明胃癌組織中HLA I類各重鏈分子表達(dá)下調(diào)與DNA高甲基化存在相關(guān)性。由于樣本數(shù)局限，臨床資料分析未發(fā)現(xiàn)HLA I類基因啟動子區(qū)域高甲基化與

6、患者臨床病理特征關(guān)聯(lián)。
　　 4、以正常胃黏膜上皮細(xì)胞細(xì)胞系GES-1為對照，選用HLA I類分子低表達(dá)代表性胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、BGC-823、MKN28為研究對象，利用MSP檢測HLA-A基因啟動子為完全甲基化狀態(tài)。用甲基化酶抑制劑5-雜氮胞苷對BGC-823進(jìn)行去甲基化藥物處理后，流式細(xì)胞術(shù)檢測到BGC-823細(xì)胞表面的HLA I類復(fù)合體和HLA-A分子表達(dá)增加：熒光定量PCR和Western blot也能檢測到細(xì)胞系中HL

7、A-A分子的表達(dá)上調(diào)；HLA-A基因啟動子區(qū)域部分去甲基化。以上結(jié)果提示HLA I類重鏈基因啟動子區(qū)域DNA異常甲基化參與調(diào)控各重鏈分子的表達(dá)，并影響到細(xì)胞表面HLA I類復(fù)合體的表達(dá)，HLA I類重鏈基因區(qū)域的DNA高甲基化可能是調(diào)控胃癌組織HLA I類分子表達(dá)下調(diào)的重要機(jī)制之一。
　　 5、應(yīng)用免疫磁珠分選方法，以腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD133分子為篩選目標(biāo)，從BGC-823細(xì)胞系中分離帶CD133標(biāo)志的腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞群。與未

8、分選細(xì)胞相比，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)、半定量RT-PCR以及Western blot等檢測CD133陽性細(xì)胞群和CD133陰性細(xì)胞群中HLA I類抗原及其加工分子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)除β2m和HLA-C表達(dá)沒有差異外，CD133陽性細(xì)胞群中多個HLA I類及其相關(guān)分子轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)低于CD133陰性群和未分選細(xì)胞群；CD133陽性細(xì)胞群細(xì)胞表面的HLA I類復(fù)合物以及HLA-A表達(dá)低于其他兩群細(xì)胞。
　　 以上研究結(jié)果提示HLA I類基因啟動子區(qū)