血清饑餓下調(diào)BAG3表達(dá)的分子機(jī)制及其作用.pdf

1、目的:
　　 所謂自噬是指細(xì)胞利用溶酶體降解自身成分的過程，被降解成分包括細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器。細(xì)胞自噬是一種分解代謝過程，它可以使細(xì)胞循環(huán)再利用細(xì)胞漿內(nèi)的成分，因此從節(jié)省生物能的角度看，細(xì)胞自噬是細(xì)胞內(nèi)各種成分重新合成的有效替代途徑。根據(jù)細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)送到溶酶體途徑的不同，自噬可以分為:巨自噬，微自噬，分子伴侶介導(dǎo)的自噬。眾多研究顯示細(xì)胞主要通過自噬途徑消化長壽命的蛋白和細(xì)胞器，在細(xì)胞應(yīng)激情況下，如饑餓、去除細(xì)胞因子等，自噬多數(shù)起保護(hù)細(xì)

2、胞的作用;但在某些特定的情況下，當(dāng)細(xì)胞自噬過度發(fā)生時又可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。所以，自噬對于細(xì)胞的存活和死亡起到雙刃劍的作用。
　　 BAG3是Bcl-2相關(guān)抗凋亡家族蛋白的重要成員，BAG3蛋白含有WW結(jié)構(gòu)域，與Bcl-2和Hsp70相互作用的BAG結(jié)構(gòu)域，以及一個具有多個PXXP基序的脯氨酸富含區(qū)域，該蛋白主要分布于細(xì)胞漿。除骨骼及心肌組織BAG3具有較高表達(dá)水平之外，在其它正常組織中BAG3的表達(dá)很弱或者不表達(dá);而在一些腫瘤細(xì)胞如

3、白血病、實體性腫瘤細(xì)胞內(nèi)BAG3表達(dá)水平較高，維持腫瘤細(xì)胞的存活。研究證實，重金屬（鋅、鎘）、高溫、蛋白酶體抑制劑等應(yīng)激在轉(zhuǎn)錄水平誘導(dǎo)BAG3表達(dá)，現(xiàn)證實HSF1、Egrl等轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控BAG3的表達(dá)。最近BAG3在自噬中的作用受到極大關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)BAG3可以和HSPB8、HSP70形成復(fù)合物，直接促進(jìn)錯誤折疊蛋白（如亨廷頓polyQ、變異SOD1）向聚集體的運(yùn)輸，進(jìn)而調(diào)控錯誤折疊蛋白和蛋白聚集體的選擇性自噬。
　　 本實驗在

4、已有的研究基礎(chǔ)上，利用血清饑餓對細(xì)胞產(chǎn)生饑餓影響，觀察細(xì)胞內(nèi)BAG3水平的改變，及對細(xì)胞生存能力的影響，為進(jìn)一步理解BAG3在調(diào)控細(xì)胞生存能力中的作用及分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1、培養(yǎng)HEK293、MCF7、FRO、LK87、SKVO3、HepG2細(xì)胞;BAG3穩(wěn)定過表達(dá)的HEK293、MCF7、U87細(xì)胞;EGFP-LC3B穩(wěn)定過表達(dá)的HEK293細(xì)胞;利用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染技術(shù)瞬時轉(zhuǎn)染pcDNA3.1、c

5、-Jun、c-Jun(DBD)表達(dá)載體或?qū)φ铡?br>　　 2、應(yīng)用Real-Time PCR法檢測對照組與實驗組中BAG3、JunD的mRNA表達(dá)變化。
　　 3、應(yīng)用Western Blot法檢測對照組與實驗組中BAG3、JunD、c-Jun的蛋白表達(dá)差異。
　　 4、應(yīng)用Click-iT(R) Nascent RNA Capture試劑盒標(biāo)記并分離新生mRNA。
　　 5、應(yīng)用染色質(zhì)免疫沉淀法分析c-Ju

6、n與BAG3啟動子的相互作用關(guān)系。
　　 6、應(yīng)用MTT比色分析法、Hoechst染色、Trypan blue分別檢測BAG3對細(xì)胞生存能力、凋亡、死亡的影響;應(yīng)用廣譜凋亡抑制劑z-VAD觀察凋亡在增殖抑制中的作用。
　　 7、應(yīng)用PI染色、流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞周期變化。
　　 8、自噬的檢測:應(yīng)用AO熒光染料染色，觀察細(xì)胞內(nèi)酸性泡數(shù)量及結(jié)構(gòu)的變化;熒光顯微鏡觀察EGFP-LC3B的分布;Western blot

7、檢測LC3由Ⅰ型向Ⅱ型的轉(zhuǎn)變。
　　 9、自噬抑制劑3-MA檢測自噬在增殖抑制中的作用。
　　 結(jié)果:
　　 1、血清饑餓在多種細(xì)胞中下調(diào)了BAG3的表達(dá)。
　　 2、血清饑餓在轉(zhuǎn)錄水平通過c-Jun降低BAG3表達(dá)。
　　 3、BAG3增加血清饑餓抑制細(xì)胞增殖的能力。
　　 4、BAG3抑制血清饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬水平增加程度。
　　 5、BAG3增加血清饑餓抑制細(xì)胞增殖的能力與自