NMDA受體激活在急性肺損傷CCTα表達(dá)下調(diào)中的作用及機(jī)制.pdf

1、第一章 MK801對(duì)小鼠油酸型肺損傷的保護(hù)作用研究背景急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是臨床常見(jiàn)危重疾病，發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。肺內(nèi)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的滯留和激活在ARDS的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞可釋放谷氨酸。Said等人發(fā)現(xiàn)谷氨酸離子型受體特異性激動(dòng)劑N-甲基-D-門(mén)冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)可引起離體灌流肺發(fā)

2、生高通透性肺水腫。近年來(lái)本室的研究還發(fā)現(xiàn)NMDA受體阻斷劑MK-801對(duì)脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)和高氧等引起的肺損傷具有明顯的保護(hù)作用，這些研究進(jìn)一步提示內(nèi)源性谷氨酸(Glutamate，Glu)的大量釋放過(guò)度激活NMDA受體參與急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。但為證明內(nèi)源性Glu的大量釋放過(guò)度激活NMDA受體在急性肺損傷的發(fā)生中具有普遍意義，尚有待在不同模型上進(jìn)一步證實(shí)。 方法：(1)建立小鼠急性油酸肺

3、損傷模型；(2)測(cè)量肺濕重和干重的比值(W/D)并觀(guān)察肺組織病理變化，以反映腫組織的損傷程度；(3)測(cè)定支氣管肺泡灌洗液中蛋白和白細(xì)胞含量，以反映支氣管肺泡毛細(xì)血管通透性變化；(4)生化測(cè)定腫組織髓過(guò)氧化物酶(MPO)，反映氧化損傷時(shí)的肺炎性改變；(5)RT-PCR和免疫組化分別檢測(cè)CTP:磷酸膽堿二胞苷?；D(zhuǎn)移酶α(CTP：phosphocholine cytidylyltransferase alpha，CCTα)mRNA和蛋白水平

4、，反映CCTα轉(zhuǎn)錄合成的變化。 結(jié)果：油酸(0.1 ml/kg)尾靜脈注射4 h可引起腫組織肺指數(shù)、肺濕干重比W/D增加、肺組織MPO活性增加，支氣管肺泡灌洗液中蛋白和白細(xì)胞含量明顯增加，并引起肺組織CCTα mRNA和蛋白水平的明顯減低，病理切片示水腫、炎癥滲出明顯。NMDA受體的阻斷劑MK-801(0.1mg/kg，ip)預(yù)處理30 min可減輕油酸引起的上述變化。 結(jié)論：油酸引起明顯以炎性滲出為主的急性腫損傷，肺內(nèi)

5、NMDA受體的激活參與油酸急性腫損傷的發(fā)生，并引起CCTα表達(dá)的下調(diào)。 第二章 研究背景：CTP：磷酸膽堿二胞苷?；D(zhuǎn)移酶(CTP：phosphocholine cytidylyltransferase alpha，CCTα)是磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine，PC)合成中的關(guān)鍵調(diào)控酶。CCTα基因近端啟動(dòng)子區(qū)包含多個(gè)與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Sp1(specificity protein 1)

6、結(jié)合位點(diǎn)。探討Sp1在CCTα啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄中的作用具有一定的意義。在急性肺損傷(acute lung injury，ALI)及ARDS等腫部損傷疾病中，肺表面活性物質(zhì)(pulmonary surfactant，PS)系統(tǒng)功能的異常并參與肺損傷的發(fā)生過(guò)程。本室前期研究證明一定劑量NMDA作用后，肺Ⅱ型上皮細(xì)胞合成CCT mRNA水平、CCTα蛋白表達(dá)水平均下降。本研究旨在觀(guān)察NMDA受體激活后Sp1的改變，探討NMDA抑制CCTα表達(dá)的分子機(jī)

7、制。 方法： (1)螢光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)CCTα啟動(dòng)子活性；(2)熒光定量PCR定量檢測(cè)Sp1表達(dá)質(zhì)粒后CCTα mRNA；(3)Westem blot檢測(cè)A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染Sp1表達(dá)質(zhì)粒后CCTα蛋白含量表達(dá)水平；(4)Westem blot檢測(cè)A549細(xì)胞經(jīng)NMDA處理后Sp1蛋白含量表達(dá)水平；(5)熒光定量PCR定量檢測(cè)A549細(xì)胞經(jīng)NMDA處理后Sp1mRNA水平；(6)EMSA檢測(cè)CCTα啟動(dòng)子上Sp1的DNA結(jié)合活

8、性及NMDA處理對(duì)其影響。 結(jié)果 轉(zhuǎn)染Sp1真核表達(dá)質(zhì)粒30 h后，A549細(xì)胞CCTα核心啟動(dòng)子報(bào)告基因相對(duì)螢光素酶活性增加，A549細(xì)胞CCTα m RNA表達(dá)水平表達(dá)水平增高。轉(zhuǎn)染Sp1真核表達(dá)質(zhì)粒36 h后，CCTα蛋白表達(dá)水平表達(dá)水平增高。A549細(xì)胞經(jīng)NMDA處理8 h后，Sp1蛋白表達(dá)明顯下降，并呈時(shí)間、劑量依賴(lài)。Sp1 mRNA水平?jīng)]有明顯的改變。EMSA檢測(cè)顯示，NMDA處理后A549細(xì)胞的核蛋白中轉(zhuǎn)錄因子