NMDA受體的激活引起肺損傷及機(jī)制研究.pdf

1、第一章NMDA受體激活引起小鼠急性肺損傷研究 背景:N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體是谷氨酸受體的重要亞型。NMDA受體過度激活引起的興奮性神經(jīng)毒性是引起神經(jīng)細(xì)胞損傷的最后共同通路，在多種急慢性腦損傷的發(fā)生中起有重要作用。近年來發(fā)現(xiàn)NMDA受體在肺臟也有較高水平的表達(dá)，但生物學(xué)意義尚不清楚。 急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是臨床常見危重疾病，發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。肺內(nèi)中性粒細(xì)胞的滯留和肺內(nèi)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的激

2、活在ARDS的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵性作用。中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞可釋放谷氨酸。膿毒癥時肺靜脈中谷氨酸濃度明顯高于肺動脈，提示在ARDS等疾病狀態(tài)下，肺組織中的NMDA受體有可能被過度激活。Said等人發(fā)現(xiàn)NMDA可引起離體灌流肺發(fā)生高通透性肺水腫。本室前期工作觀察到NMDA受體阻斷劑MK-801對腹腔注射谷氨酸引起的小鼠急性肺損傷具有明顯的保護(hù)作用，提示在器官水平和整體水平，NMDA受體激活可引起肺損傷。在整體水平研究NMDA受體激活后對肺組

3、織的影響及可能的作用機(jī)制，將為深入研究肺臟等外周組織中NMDA受體的病理生理意義，拓展肺部疾病的防治研究提供新的思路。 方法: 1.測量肺濕重和干重比值(W/D)并觀察組織病理變化，以反映肺組織的損傷程度。 2.生化試劑盒測定肺組織髓過氧化物酶(MPO)活性的改變以反映肺內(nèi)中性粒細(xì)胞的浸潤程度。 3.尾靜脈取血，記數(shù)中性粒細(xì)胞百分比，反映外周血中性粒細(xì)胞的數(shù)目。 4.Wastern blot方法測

4、定肺組織proSP-C和CCTα蛋白水平，反映肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的功能。 結(jié)論:在整體條件下，NMDA可引起急性肺損傷，其機(jī)制與中性粒細(xì)胞的募集和肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的功能障礙有關(guān)。 第二章NMDA受體在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的表達(dá) 背景:第一部分研究首次在整體水平證實NMDA受體的激活具有肺毒性效應(yīng)，但其肺毒性機(jī)制未完全闡明。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(ATⅡ)具有合成分泌表面活性物質(zhì)(PS)的特性，是維持肺泡正常功能和結(jié)構(gòu)的重要細(xì)

5、胞。表面活性物質(zhì)結(jié)合蛋白一C的前體蛋白proSP-C僅存在于ATⅡ中，是ATⅡ的特征性蛋白。CTP：磷酸膽堿二胞苷酰基轉(zhuǎn)移酶α(CCTα)是合成Ps主要脂質(zhì)成分磷脂酰膽堿(PC)的關(guān)鍵酶。腹腔注射NMDA可以使肺組織proSP-C和CCTα表達(dá)減少，表明肺組織合成PS脂質(zhì)成分和蛋白成分的能力下降，提示ATⅡ受損。但NMDA是直接對ATⅡ發(fā)揮損傷作用，還是通過作用于其他細(xì)胞啟動損傷效應(yīng)、釋放損傷性介質(zhì)從而間接導(dǎo)致ATⅡ的損害，尚有待于進(jìn)一

6、步的探索。 NRl是構(gòu)成NMDA受體的必需組份。研究表明在肺組織的外周、中段、主干均有NRl的mRNA及蛋白的表達(dá)。放射配基結(jié)合實驗也證實在肺泡壁上有NMDA受體表達(dá)，但在ATⅡ細(xì)胞，NMDA受體有無表達(dá)尚無直接的證據(jù)。 方法: 1．免疫組織化學(xué)(SABC法和雙標(biāo)記法)技術(shù)檢測在人肺組織ATⅡ細(xì)胞上NRl的表達(dá)。 2．原代分離的大鼠ATⅡ細(xì)胞經(jīng)免疫黏附法純化2次后，用堿性磷酸酶(AKP)染色鑒定純度.

7、 3．RT—PCR法和Western blot分別檢測ATⅡ細(xì)胞上NRl的mRNA和蛋白分子。免疫細(xì)胞化學(xué)觀察ATⅡ細(xì)胞上NRl的表達(dá)。 結(jié)論ATⅡ細(xì)胞有NMDA受體的NRl亞單位表達(dá)。 第三章 NMDA對肺表面活性物質(zhì)合成的影響 背景:肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(ATⅡ)是肺泡上皮的主要組成細(xì)胞，可以合成分泌肺表面活性物質(zhì)(PS)。ATⅡ細(xì)胞或PS的受損在ARDS、肺纖維化多種肺部疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

8、 磷脂酰膽堿(PC)是PS中脂質(zhì)的主要成分。CTP：磷酸膽堿二胞苷?；D(zhuǎn)移酶(CCTα)是PC合成的限速酶，也是PC生物合成的重要調(diào)控部位。第三部分的研究發(fā)現(xiàn)ATⅡ有NMDA受體表達(dá)。前期研究已經(jīng)在整體水平證實NMDA受體的激活可導(dǎo)致肺組織CCTα蛋白水平下降；在組織培養(yǎng)水平證實NMDA受體的激活可降低肺組織CCTαmRNA的水平，抑制肺組織PC生物合成；但是在細(xì)胞水平NMDA可否直接影響PS的合成仍有待于進(jìn)一步的研究。 方法

9、 液閃記數(shù)測定[<'3>H]氯化膽堿的摻入量，反映PC合成的變化。 RT-PCR和Western blot分別測定CCTα的mRNA水平和微粒體中的CCTα蛋白水平，揭示PC合成變化的生物化學(xué)機(jī)制。 Real time PCR測定CCTα和SP-A、SP-B、SP-C、SP-D的mRNA水平，反映CCTα和SPs轉(zhuǎn)錄水平的變化。 結(jié)論:NMDA可通過減少CCTα的轉(zhuǎn)錄，降低高活性的CCTα蛋白水平，導(dǎo)致P

10、C合成減少。NMDA對SP-B、SP-C、SP-D的轉(zhuǎn)錄也有抑制作用。 第四章 NMDA抑制CTP：磷酸膽堿二胞苷?；D(zhuǎn)移酶表達(dá)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究 背景:肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(ATⅡ)合成分泌的肺表面活性物質(zhì)(PS)是維持正常呼吸功能不可缺少的生物活性物質(zhì)。CTP：磷酸膽堿二胞苷酰基轉(zhuǎn)移酶α(CCTα)是PS主要脂質(zhì)成分磷脂酰膽堿(PC)合成的限速酶。 在CCTα基因近端啟動子存在核因子k B(NFkB)的結(jié)合位點

11、，但NFkB對CCTα轉(zhuǎn)錄有何影響未見報道。神經(jīng)細(xì)胞在受到興奮性毒性損傷時核內(nèi)NFkB活性增強(qiáng)，在此過程中一氧化氮合酶(NOS)活化是NFkB激活的上游事件。在整體實驗和離體灌流肺模型的研究表明，NOS的激活是導(dǎo)致NMDA肺組織損傷的重要環(huán)節(jié)。本室在細(xì)胞水平的研究中發(fā)現(xiàn)NMDA可以抑制ATⅡ細(xì)胞CCTα的轉(zhuǎn)錄，推測在該效應(yīng)中，與興奮性神經(jīng)毒性相似，NMDA激活NOS并由此導(dǎo)致NFkB活化，從而調(diào)節(jié)CCTα的轉(zhuǎn)錄。 方法:

12、 Western blot測定細(xì)胞核中P65蛋白水平的變化，反映NFkB的激活：測定CCTα蛋白水平，反映CCTα的表達(dá)變化。 生化試劑盒測定細(xì)胞中一氧化氮合酶(NOS)活性和釋放到培養(yǎng)液中的一氧化氮(NO)量；Western blot檢測NOS阻斷劑L-NNA預(yù)處理對細(xì)胞核中P65蛋白水平的影響，反映NOS在NFkB活化過程中的作用。 結(jié)論:NMDA通過激活NFkB抑制CCTα的表達(dá)，NOS活化是激活NFkB的上游途徑