Bis(7)-tacrine對NMDA受體的作用及其機制研究.pdf

1、第一部分
　　 阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)發(fā)病機制與膽堿能神經元功能缺損以及神經元凋亡均有密切關系。在治療AD，特別是防止AD及其它神經退行性病變方面，兼具抗凋亡作用的乙酰膽堿酯酶抑制劑如bis(7)-tacrine將會比單純的乙酰膽堿酯酶抑制劑發(fā)揮更有效的作用。本實驗通過膜片鉗技術，利用原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經元，將bis(7)-tacrine與tacrine和memantine對N-methy

2、l-D-aspartate(NMDA)電流的抑制作用做比較，并進一步研究bis(7)-tacrinec對NMDA受體的作用機制。結果顯示，三種藥物均選擇性地作用于NMDA受體，濃度依賴性地抑制NMDA電流，其IC50值分別為3.61±0.78 μM，112.33±19.83 μM和8.82±1.03 μM。Tacrine和memantine均為“開放通道阻滯劑”，作用于NMDA受體通道的內部，表現(xiàn)為“激動劑依賴性”和“電壓依賴性”；前者

3、與NMDA受體結合與解離的速度更快，25 μM以上濃度tacrine與NMDA同時作用時，停藥后產生一內向延遲電流峰。而bis(7)-tacrine對NMDA電流的抑制作用不同于tacrine和memantine，提前1 s給藥能明顯提高bis(7)-tacrine的抑制作用，但提前更長時間(2-90 s)并無進一步抑制。在鉗制電壓-50至+50mV的范圍內，bis(7)-tacrine對NMDA電流的抑制率沒有變化，I-V曲線的翻轉電

4、位也沒有改變。Bis(7)-tacrine沒有明顯改變NMDA的EC50值 [49.48±2.93 μM in the absence of bis(7)-tacrine vs 57.32±8.43 μM in the presence of bis(7)-tacrine；ANOVA，P﹥0.05；n =7-8]，但使NMDA最大反應濃度(Emax)降低了約40[％](ANOVA，P＜0.05；n =7-8)，顯示bis(7)-tacr

5、ine的作用為非競爭性地抑制NMDA激活電流。結果提示，作為一種新型二聚體膽堿酯酶抑制劑，bis(7)-tacrine對NMDA激活電流的的抑制作用強于tacrine和memantine，其作用機制也與它們不同，是以慢作用方式、非競爭性地抑制NMDA激活電流，其臨床使用的效能和安全性可能較高。
　　 第二部分
　　 最近的研究證實，bis(7)-tacrine除作為一種乙酰膽堿酯酶抑制劑外，還可通過抑制原代培養(yǎng)大鼠小腦顆

6、粒細胞NMDA受體而防止谷氨酸導致的神經元凋亡。本實驗通過全細胞膜片鉗記錄研究bis(7)-tacrine對原代培養(yǎng)大鼠海馬神經元NMDA受體可能的作用位點。結果發(fā)現(xiàn)，細胞外液中甘氨酸的濃度從0.1 μM增加至10 μM，細胞外液pH值從8.1改變到6.7，在細胞外液中加入二硫蘇糖醇(2 mM)、精胺(10 μM)、鎂離子(10至100 μM)或鋅離子(5至20 μM)均不引起bis(7)-tacrine對NMDA電流抑制率的改變。電極

7、內液中加入25 μM bis(7)-tacrine也未觀察到外加的2.5 μM bis(7)-tacrine對30 μM NMDA激活電流抑制率的改變(37±3[％] vs 對照組 36±4[％]，P﹥0.05；n =4)。但是，2.5 μM bis(7)-tacrine及5 μM dizocilpine(MK-801)分別對30 μM NMDA激活電流抑制了36[％]和22[％]，而在兩種藥物都存在的條件下，30 μM NMDA電流僅

8、被抑制了37[％]。結果提示，bis(7)-tacrine雖然不大可能作用于MK-801位點，但MK-801卻可以負性調制bis(7)-tacrine對NMDA受體的抑制作用。
　　 第三部分
　　 在正常大鼠前腦，NMDA 受體復合物的構成形式主要是NR1/NR2A和NR1/NR2B的二合體形式，少部分以NR1/NR2A/NR2B的三合體形式存在。因此，我們進一步通過表達NR1/NR2A或NR1/NR2B受體到培養(yǎng)的H

9、EK-293細胞，利用膜片鉗技術來研究bis(7)-tacrine對NMDA電流的抑制作用。結果顯示，在同時給藥的情況下，作用于表達了NR1/NR2A受體的HEK-293細胞時，1 μM bis(7)-tacrine對30 μM NMDA和1000 μM NMDA激活穩(wěn)態(tài)電流的抑制分別為46[％]和40[％](ANOVA，P﹥0.05；n =5)，顯示其作用方式可能與NMDA濃度無關，可能為非競爭性抑制；而作用于表達了NR1/NR2B受

10、體的HEK-293細胞時，1 μM bis(7)-tacrine對NMDA電流的抑制與NMDA濃度有關，對30 μM NMDA和1000 μM NMDA激活穩(wěn)態(tài)電流的抑制分別為61[％]和13[％](ANOVA，P＜0.05；n =6)，這似乎是一種競爭性的作用方式。但在1000 μM NMDA作用條件下，同時給予1 μM bis(7)-tacrine對NMDA激活電流峰值產生了一定的抑制作用，電流逐漸下降到穩(wěn)態(tài)，而在同一細胞上提前5秒

11、給予1 μM bis(7)-tacrine卻可以將峰值幾乎完全抑制。這一結果表明，bis(7)-tacrine對表達NR1/NR2B受體NMDA電流的抑制作用可能為慢作用方式，并不依賴于激動劑的存在。鉗制電壓從-50到+50mV變動范圍內，bis(7)-tacrine對NMDA電流的抑制率沒有發(fā)生變化，而且其翻轉電位沒有改變。這些結果與我們前面用培養(yǎng)的海馬神經元實驗結果趨于一致，證明bis(7)-tacrine作用于表達的NR1/NR2