他克莫司生物合成相關(guān)基因研究及其產(chǎn)生菌遺傳改造.pdf_第1頁(yè)
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1、他克莫司(FK506)是由鏈霉菌產(chǎn)生的一種23元大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑,是肝和腎等器官移植后抗排斥反應(yīng)的一線用藥,已在多個(gè)國(guó)家上市。然而作為一種微生物的發(fā)酵產(chǎn)物,F(xiàn)K506存在效價(jià)低、副產(chǎn)物多等問題。因此,通過研究其產(chǎn)生菌中影響FK506生物合成的相關(guān)基因,能夠?yàn)橥ㄟ^基因工程改善該菌的發(fā)酵特性、降低生產(chǎn)成本等創(chuàng)造有利條件。
  本研究以鏈霉菌Streptomyces sp.TL01為出發(fā)菌株,研究了FK506生物合成及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子

2、編碼基因、次級(jí)代謝相關(guān)基因以及外源的顫血紅蛋白編碼基因分別對(duì)菌株發(fā)酵和代謝產(chǎn)物生物合成的影響。以LuxR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子編碼基因fkbN,LysR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子編碼基因tcs7,初級(jí)代謝途徑中參與合成或消耗NADPH的酶編碼基因zwf2和gltD,催化乙酰CoA生成丙二酰CoA的酶編碼基因bccA2,催化他克莫司生物合成后修飾的C31位氧甲基化酶編碼基因fkbM,及用于提高菌株氧結(jié)合水平的顫血紅蛋白編碼基因vgb等作為目標(biāo)基因,借

3、助分子生物學(xué)的手段,通過酶切酶連完成重組質(zhì)粒構(gòu)建后,經(jīng)大腸桿菌-鏈霉菌的屬間接合轉(zhuǎn)移,將構(gòu)建好的質(zhì)粒導(dǎo)入到受體菌Streptomyces sp.TL01中,篩選獲得基因工程菌后,搖瓶發(fā)酵考察其發(fā)酵特性。
  HPLC分析顯示:fkbN倍增菌株發(fā)酵效價(jià)降低32%,fkbN基因敲除菌株不產(chǎn)FK506;tcs7的倍增菌株發(fā)酵效價(jià)降低了54%,敲除菌株發(fā)酵效價(jià)增加6%,發(fā)酵水平基本與出發(fā)菌株相當(dāng);zwf2基因倍增菌株發(fā)酵效價(jià)增加13%;

4、bccA2敲除菌株發(fā)酵效價(jià)降低9%;而gltD的敲除使FK506的發(fā)酵效價(jià)增加135%; fkbM基因倍增菌株發(fā)酵效價(jià)增加13%;而整合表達(dá)啦的Streptomyces sp.TL01,其FK506發(fā)酵效價(jià)變化不大,但菌體干重明顯增加。
  由結(jié)果推測(cè)fkbN可能為FK506生物合成所必需的負(fù)調(diào)控基因,tcs7則對(duì)他克莫司的合成起負(fù)調(diào)控作用;zwf2和bccA2的倍增對(duì)他克莫司發(fā)酵單位影響不大;而gltD敲除菌株發(fā)酵效價(jià)明顯提高;

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