口服食物抗原誘導的類風濕性關(guān)節(jié)炎動物模型的建立及評價.pdf

1、類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以慢性、進行性、侵襲性關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的全身性自身免疫疾病。如果不經(jīng)過正規(guī)治療,患者病情會逐漸發(fā)展,最終導致關(guān)節(jié)畸形、功能喪失。RA具有很高的致殘率,嚴重影響患者的健康和生活質(zhì)量,同時也給患者家庭和社會造成巨大的經(jīng)濟負擔。
　　 眾多研究已表明食物與RA的發(fā)生密切相關(guān)。目前通過皮下注射Ⅱ型膠原蛋白誘導的RA模型是最佳的RA實驗動物模型。盡管通過注射的方式能成功有

2、效地誘導大鼠產(chǎn)生類風濕關(guān)節(jié)炎,但皮下注射的誘導方式并不符合人體攝食模式,其忽略了胃腸道在RA發(fā)病中的重要性,使RA發(fā)病機制的研究出現(xiàn)了一個極為重要的空白點:即食物抗原在人體攝食過程中如何通過腸上皮粘膜屏障進入腸道粘膜固有層,引起腸道相關(guān)免疫組織細胞的一系列免疫應(yīng)答,擾亂腸粘膜免疫組織的固有與適應(yīng)性免疫反應(yīng),并通過分子擬態(tài)和旁觀者效應(yīng)打破免疫耐受,進而導致RA發(fā)生的機理。為了深入RA發(fā)病機制的研究,建立一種與人RA發(fā)病機制及病理相同或相似

3、的動物模型(口服食物抗原誘導的RA動物模型)在RA研究中的作用也就顯得尤為重要。
　　 目的:
　　 建立口服牛Ⅱ型膠原蛋白誘導的RA大鼠模型；確定口服食物抗原與RA的相關(guān)性；并在動物模型的基礎(chǔ)上,對腸道通透性在食物抗原誘導的RA發(fā)病機理中的作用進行初步探索,為臨床RA的預防和治療提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 本研究選擇Wistar大鼠作為實驗動物。從牛軟骨中提取牛Ⅱ型膠原蛋白,先用阿司匹林破壞大鼠

4、的腸道粘膜屏障功能,然后灌胃給予大鼠較大劑量的牛Ⅱ型膠原蛋白,誘導大鼠類風濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。將4～5周齡雌性Wistar大鼠隨機分成四組:對照組(生理鹽水；生理鹽水)、M1組(生理鹽水；生理鹽水+CCl4+LPS)、M2組(5mg／kg阿司匹林；牛Ⅱ型膠原蛋白+CCl4+LPS)、M3組(10mg／kg阿司匹林；牛Ⅱ型膠原蛋白+CCl4+LPS)。在阿司匹林灌胃期間,每七天灌胃給予大鼠一定量的乳果糖和甘露醇,用代謝籠收集大鼠24h尿,高效

5、液相色譜儀(HPLC)檢測并計算乳果糖、甘露醇比值(L／M),并將M2組、M3組與對照組相比,間接評價大鼠腸道通透性的變化情況。建模過程中,用游標卡尺測量并記錄大鼠右后腿踝關(guān)節(jié)的直徑,兩周一次,一共5次,并進行關(guān)節(jié)指數(shù)(AI)評定。建模結(jié)束后,取大鼠血清、空腸組織和踝關(guān)節(jié)組織。采用雙抗體夾心ELISA法測定各組大鼠血清中牛Ⅱ型膠原蛋白特異性抗體水平、細胞因子TNF-a、IFN-r和IL-4水平；將所取實驗動物的空腸和踝關(guān)節(jié)組織用固定液固

6、定后,石蠟包埋切片,蘇木素-伊紅(HE)染色,光學顯微鏡下觀察其病理形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化以及淋巴細胞浸潤滲透的情況；用熒光免疫組織化學的方法,以小鼠來源的牛Ⅱ型膠原蛋白單克隆抗體作為一抗,以FITC標記的山羊抗小鼠的IgG作為二抗,定位空腸中的牛Ⅱ型膠原蛋白,觀察其是否能夠通過腸粘膜的屏障從而進入腸道粘膜固有層；用熒光免疫組織化學的方法,以小鼠來源的牛Ⅱ型膠原蛋白單克隆抗體作為一抗,以FITC標記的山羊抗小鼠的IgG作為二抗,定位關(guān)節(jié)滑膜上的

7、牛Ⅱ型膠原蛋白,觀察其在關(guān)節(jié)滑膜上的沉積情況。通過以上指標對所建立的類風濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型進行綜合評價。
　　 結(jié)果:
　　 在建模結(jié)束后,M2組、M3組大鼠踝關(guān)節(jié)呈現(xiàn)不同程度的腫脹；M2組、M3組大鼠血清中抗牛Ⅱ型膠原蛋白特異性抗體顯著升高(P<0.05),血清中TNF-a和IFN-r水平明顯升高(P<0.05),并且IL-4水平明顯降低(P<0.05)；M2組、M3組大鼠空腸病理學改變明顯:腸粘膜損傷嚴重,粘膜下層中性

8、粒細胞浸潤明顯,腸絨毛水腫肥大,腸粘膜上皮細胞廣泛脫落等；熒光免疫組化顯示未經(jīng)消化的大分子牛Ⅱ型膠原蛋白透過損傷的腸上皮粘膜屏障進入腸道粘膜固有層；在M2組、M3組大鼠踝關(guān)節(jié)標本組織學中觀察到滑膜組織增生,其局部骨吸收破壞明顯,軟骨表層膠原纖維松解斷裂、軟骨細胞變性壞死,軟骨表面凸凹不平等；并通過熒光免疫組化的方法觀察到M2組、M3組大鼠關(guān)節(jié)滑膜上牛Ⅱ型膠原蛋白的沉積。雙糖實驗,M2組、M3組大鼠尿中的甘露醇濃度降低(P<0.05),乳