生長抑素對豬小體積肝移植物損傷的保護及機制研究.pdf

1、部分肝移植的廣泛開展，一定程度上緩解了供肝短缺矛盾，使更多肝病患者得到及時有效的治療，但由于供肝體積較小，特別是在小體積肝移植時，常常由于供肝功能不足導致術后出現(xiàn)不同程度的小肝綜合征(SFSS)表現(xiàn)，影響受體存活，嚴重困擾部分肝移植的進一步發(fā)展。目前對SFSS的詳細發(fā)生機制并不清楚，可能與供、受體雙方多種因素有關，門靜脈高灌注損傷、肝動脈低灌注、肝內微循環(huán)障礙以及異常的肝再生與SFSS的發(fā)生發(fā)展密切相關。理想的動物模型是進行基礎和干預研

2、究的前提，非靜脈轉流下的豬小體積肝移植模型與臨床有著相似的手術操作過程和病理生理變化，不但進行了大鼠模型中不常采用而臨床必需的肝動脈重建，保留了肝動脈灌注的動態(tài)變化對SFSS發(fā)生發(fā)展的作用，而且避免了傳統(tǒng)豬移植模型中體外靜脈轉流帶來的不必要的脾臟切除及其對術后早期門脈高灌注、供肝再生等的干擾，因此特別適合SFSS的系統(tǒng)研究。生長抑素(SST)是一種多效應激素，在降低門脈血流、調節(jié)肝竇收縮、抑制肝臟纖維增生、減輕腸道缺血再灌注損傷以及抑制

3、肝細胞再生等多個方面具有重要作用，基于大鼠模型和臨床個案的研究結果顯示SST具有潛在的減輕小體積供肝損傷的作用，但是目前仍然缺少更多證據(jù)的支持。在本課題中，我們先建立非轉流下豬30％體積供肝移植模型，并評價其安全性和臨床貼合性；然后在穩(wěn)定有效的小體積肝移植模型上，進行SST的干預研究，并初步探討相關機制。
　　 一、非轉流下豬小體積肝移植物損傷模型的建立
　　 目的：建立非轉流下豬30％體積供肝移植模型，并評價其安全性和

4、臨床貼合性。
　　 材料和方法：13對巴馬小型豬，體重25～30kg，隨機分為100％全肝移植組(n=5)和30％小體積肝移植組(n=8)，均在非靜脈轉流條件下完成肝移植術。觀察比較兩組供肝特征及增重率，存活情況(非轉流耐受率、手術存活率、供肝7d累積存活率)，術中血流動力學及血氣變化，術后2h及第1、2、3、5、7d的肝腎功能變化。
　　 結果：兩組除供肝大小外，在熱缺血時間、冷缺血時間、溫缺血時間、無肝期、肝下下腔靜

5、脈阻斷時間、受體手術時間以及術中輸血量方面差異均無統(tǒng)計學意義；兩組非靜脈轉流耐受率分別為80％(4/5)和100％(8/8)，手術存活率為80％(4/5)和75％(6/8)；30％供肝組的供肝7d累積存活率明顯低于100％供肝組(33.3％vs.100％)，但由于實驗例數(shù)較少，尚無統(tǒng)計學差異(P=0.0521＞0.05)；兩組受體無肝期均出現(xiàn)相似的血流動力學改變，與無肝前期比較，MAP、CVP、PH以及BE值顯著下降(P＜0.01)，而

6、HR及血K+濃度顯著升高(P＜0.01)，但兩組間比較無統(tǒng)計學差異，門脈血流開放后，上述指標逐漸恢復，至關腹前除輕微酸中毒外已基本恢復至無肝前期水平；與100％供肝組比較，30％供肝組ALT、AST在術后5d內顯著升高(P＜0.05)，TBIL在術后1至7d顯著升高(P＜0.01)，PT同樣在術后1、2、5和7d明顯延長(P＜0.05)。兩組血清肌酐均于術后第1d達到高峰后快速恢復，組間比較沒有顯著性差異。30％供肝組的供肝平均增重率明

7、顯高于100％供肝組(152.8％vs.15.9％)。
　　 結論：非轉流下豬30％體積供肝移植模型穩(wěn)定有效，可以用于小體積肝移植物損傷的研究。
　　 二、生長抑素對豬小體積肝移植物損傷的保護作用及機制
　　 目的：研究SST對術后早期豬小體積肝移植物損傷的保護，并初步從門脈壓力梯度變化(PPG)、肝內微循環(huán)調節(jié)、肝再生及凋亡等方面探討相關機制。
　　 材料和方法：12對巴馬小型豬，體重25～30kg，隨

8、機分為30％小體積肝移植+生理鹽水對照組(小肝NS組，n=7)和30％小體積肝移植+SST干預組(小肝SST組，n=5)，均在非靜脈轉流條件下完成肝移植術，另取前一部分中手術存活的100％供肝組(全肝對照組，n=4)作為模型對照。SST-14干預方案：受體門脈開放前3min團注125μg，然后以5μg/kg/h持續(xù)給藥24h，B組以等量生理鹽水作為對照。觀察比較各組供肝特征及增重率，供肝7d累積存活率，術后2h及第1、2、3、5、7d的

9、肝腎功能變化，術后2h、3d和7d的肝臟病理改變(光鏡和電鏡)，鹽水柱法監(jiān)測術中及術后PPG的變化；免疫組化和TUNEL法分別檢測術后2h、3d和7d的Ki-67增殖指數(shù)和凋亡指數(shù)；Real-time PCR和免疫組化法分別檢測術后2h各組肝內ET-1轉錄和第3d的蛋白表達水平；ELISA法連續(xù)檢測術后2h、1、2、3、5、7d外周血ET-1和NO的濃度，并計算兩者比值。
　　 結果：
　　 1、供肝存活率：各組除供肝大

10、小外，在熱缺血時間、冷缺血時間、溫缺血時間、無肝期、肝下下腔靜脈阻斷時間、受體手術時間以及術中輸血量方面差異均無統(tǒng)計學意義；小肝SST組供肝7d累積存活率高于小肝NS組(80％vs.42.9％)，但是差異仍缺少統(tǒng)計學意義，可能與實驗例數(shù)較少有關(P=0.1283＞0.05，Log-rank test)。
　　 2、肝腎功能變化：與小肝NS組比較，小肝SST組ALT、AST在術后1、2、3d顯著下降(P＜0.05)，TBIL在術后

11、1至7d顯著下降(P＜0.05)，PT同樣在術后1至5d顯著下降(P＜0.05)。術后肌酐水平各時間點兩組比較均無顯著性差異。
　　 3、光鏡下病理檢查：小肝NS組與全肝對照組比較，術后2h肝細胞腫脹變性壞死、肝竇擴張淤血、門管區(qū)靜脈內皮損傷、出血等均較嚴重，術后第3d大量肝細胞脂肪變，肝索增厚、壞死后纖維增生、匯管區(qū)擴大及炎癥反應均較明顯，術后第7d仍然存在肝小葉結構紊亂和肝細胞空泡樣變性，可見肝細胞增殖反應；與小肝NS組比較

12、，小肝SST組各時間點的損傷、增殖及纖維化反應均較輕，肝小葉結構無明顯紊亂，炎癥反應不明顯。
　　 4、電鏡下超微結構檢查：小肝NS組與全肝對照組比較，術后2h肝細胞線粒體明顯腫脹，胞漿內可見大量脂肪滴，細胞核有固縮反應，肝竇淤血、竇內皮破壞嚴重，Disse間隙消失并可見間隙內出血；與小肝NS組比較，小肝SST組肝細胞變性輕微，線粒體輕度擴張，肝竇結構基本完整。
　　 5、PPG的變化：與全肝對照組比較，小肝NS組術后5

13、d內各時間點PPG顯著升高(P＜0.05)，并于術后30min和1d達到峰值，至術后7d基本恢復，而小肝SST組較NS組顯著降低(P＜0.05)，術后5min達到峰值后逐步下降，術后第3d基本恢復，與全肝組比較，術后各時間點及術后2d仍顯著升高(P＜0.05)。
　　 6、肝再生情況：與全肝對照組比較，小肝NS組術后2h、3d、7d的Ki-67增殖指數(shù)均顯著升高(P＜0.05)，第7d的供肝增重率明顯升高(P＜0.05)；與小肝

14、NS組比較，小肝SST組術后2h和第3d的Ki-67增殖指數(shù)顯著下降(P＜0.05)，但術后第7d兩者無顯著性差異，且兩組供肝增重率比較亦無顯著性差異。
　　 7、凋亡指數(shù)：與全肝對照組比較，小肝NS組術后2h、3d、7d的凋亡指數(shù)均顯著升高(P＜0.05)；與小肝NS組比較，小肝SST組術后各時間點凋亡指數(shù)均顯著下降(P＜0.05)。
　　 8、肝內ET-1轉錄及表達水平：與全肝對照組比較，小肝NS組術后2h ET-1

15、轉錄及第3d的蛋白表達水平均顯著升高(P＜0.05)；與小肝NS組比較，小肝SST組術后2h ET-1轉錄及第3d的蛋白表達水平均顯著降低(P＜0.05)。
　　 9、外周血ET-1/NO比值的變化：與全肝對照組比較，小肝NS組術后1、2、3d的ET/NO比值顯著升高(P＜0.05)；而小肝SST組術后除第1d顯著下降外，其余各時間點與全肝對照組無顯著性差異；與小肝NS組比較，小肝SST組術后1、2、3d的ET/NO比值顯著下降

16、(P＜0.05)。
　　 結論：
　　 1、小體積肝移植術后早期持續(xù)升高的PPG和微循環(huán)障礙與小體積供肝損傷密切相關。
　　 2、小體積肝移植術后早期肝細胞的過度增殖對于小肝功能和體積的恢復并不是必需的，甚至可能存在負面效應。
　　 3、SST-14可通過降低PPG、改善ET-1與NO介導的肝內微循環(huán)功能紊亂及減少肝細胞凋亡來保護小體積供肝功能，改善供肝7d累積存活率。
　　 4、短期SST-14