生長抑素對豬小體積肝移植物損傷的保護(hù)及機(jī)制研究.pdf

1、部分肝移植的廣泛開展，一定程度上緩解了供肝短缺矛盾，使更多肝病患者得到及時有效的治療，但由于供肝體積較小，特別是在小體積肝移植時，常常由于供肝功能不足導(dǎo)致術(shù)后出現(xiàn)不同程度的小肝綜合征(SFSS)表現(xiàn)，影響受體存活，嚴(yán)重困擾部分肝移植的進(jìn)一步發(fā)展。目前對SFSS的詳細(xì)發(fā)生機(jī)制并不清楚，可能與供、受體雙方多種因素有關(guān)，門靜脈高灌注損傷、肝動脈低灌注、肝內(nèi)微循環(huán)障礙以及異常的肝再生與SFSS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。理想的動物模型是進(jìn)行基礎(chǔ)和干預(yù)研

2、究的前提，非靜脈轉(zhuǎn)流下的豬小體積肝移植模型與臨床有著相似的手術(shù)操作過程和病理生理變化，不但進(jìn)行了大鼠模型中不常采用而臨床必需的肝動脈重建，保留了肝動脈灌注的動態(tài)變化對SFSS發(fā)生發(fā)展的作用，而且避免了傳統(tǒng)豬移植模型中體外靜脈轉(zhuǎn)流帶來的不必要的脾臟切除及其對術(shù)后早期門脈高灌注、供肝再生等的干擾，因此特別適合SFSS的系統(tǒng)研究。生長抑素(SST)是一種多效應(yīng)激素，在降低門脈血流、調(diào)節(jié)肝竇收縮、抑制肝臟纖維增生、減輕腸道缺血再灌注損傷以及抑制

3、肝細(xì)胞再生等多個方面具有重要作用，基于大鼠模型和臨床個案的研究結(jié)果顯示SST具有潛在的減輕小體積供肝損傷的作用，但是目前仍然缺少更多證據(jù)的支持。在本課題中，我們先建立非轉(zhuǎn)流下豬30％體積供肝移植模型，并評價其安全性和臨床貼合性；然后在穩(wěn)定有效的小體積肝移植模型上，進(jìn)行SST的干預(yù)研究，并初步探討相關(guān)機(jī)制。
　　 一、非轉(zhuǎn)流下豬小體積肝移植物損傷模型的建立
　　 目的：建立非轉(zhuǎn)流下豬30％體積供肝移植模型，并評價其安全性和

4、臨床貼合性。
　　 材料和方法：13對巴馬小型豬，體重25～30kg，隨機(jī)分為100％全肝移植組(n=5)和30％小體積肝移植組(n=8)，均在非靜脈轉(zhuǎn)流條件下完成肝移植術(shù)。觀察比較兩組供肝特征及增重率，存活情況(非轉(zhuǎn)流耐受率、手術(shù)存活率、供肝7d累積存活率)，術(shù)中血流動力學(xué)及血氣變化，術(shù)后2h及第1、2、3、5、7d的肝腎功能變化。
　　 結(jié)果：兩組除供肝大小外，在熱缺血時間、冷缺血時間、溫缺血時間、無肝期、肝下下腔靜

5、脈阻斷時間、受體手術(shù)時間以及術(shù)中輸血量方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；兩組非靜脈轉(zhuǎn)流耐受率分別為80％(4/5)和100％(8/8)，手術(shù)存活率為80％(4/5)和75％(6/8)；30％供肝組的供肝7d累積存活率明顯低于100％供肝組(33.3％vs.100％)，但由于實驗例數(shù)較少，尚無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.0521＞0.05)；兩組受體無肝期均出現(xiàn)相似的血流動力學(xué)改變，與無肝前期比較，MAP、CVP、PH以及BE值顯著下降(P＜0.01)，而

6、HR及血K+濃度顯著升高(P＜0.01)，但兩組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異，門脈血流開放后，上述指標(biāo)逐漸恢復(fù)，至關(guān)腹前除輕微酸中毒外已基本恢復(fù)至無肝前期水平；與100％供肝組比較，30％供肝組ALT、AST在術(shù)后5d內(nèi)顯著升高(P＜0.05)，TBIL在術(shù)后1至7d顯著升高(P＜0.01)，PT同樣在術(shù)后1、2、5和7d明顯延長(P＜0.05)。兩組血清肌酐均于術(shù)后第1d達(dá)到高峰后快速恢復(fù)，組間比較沒有顯著性差異。30％供肝組的供肝平均增重率明

7、顯高于100％供肝組(152.8％vs.15.9％)。
　　 結(jié)論：非轉(zhuǎn)流下豬30％體積供肝移植模型穩(wěn)定有效，可以用于小體積肝移植物損傷的研究。
　　 二、生長抑素對豬小體積肝移植物損傷的保護(hù)作用及機(jī)制
　　 目的：研究SST對術(shù)后早期豬小體積肝移植物損傷的保護(hù)，并初步從門脈壓力梯度變化(PPG)、肝內(nèi)微循環(huán)調(diào)節(jié)、肝再生及凋亡等方面探討相關(guān)機(jī)制。
　　 材料和方法：12對巴馬小型豬，體重25～30kg，隨

8、機(jī)分為30％小體積肝移植+生理鹽水對照組(小肝NS組，n=7)和30％小體積肝移植+SST干預(yù)組(小肝SST組，n=5)，均在非靜脈轉(zhuǎn)流條件下完成肝移植術(shù)，另取前一部分中手術(shù)存活的100％供肝組(全肝對照組，n=4)作為模型對照。SST-14干預(yù)方案：受體門脈開放前3min團(tuán)注125μg，然后以5μg/kg/h持續(xù)給藥24h，B組以等量生理鹽水作為對照。觀察比較各組供肝特征及增重率，供肝7d累積存活率，術(shù)后2h及第1、2、3、5、7d的

9、肝腎功能變化，術(shù)后2h、3d和7d的肝臟病理改變(光鏡和電鏡)，鹽水柱法監(jiān)測術(shù)中及術(shù)后PPG的變化；免疫組化和TUNEL法分別檢測術(shù)后2h、3d和7d的Ki-67增殖指數(shù)和凋亡指數(shù)；Real-time PCR和免疫組化法分別檢測術(shù)后2h各組肝內(nèi)ET-1轉(zhuǎn)錄和第3d的蛋白表達(dá)水平；ELISA法連續(xù)檢測術(shù)后2h、1、2、3、5、7d外周血ET-1和NO的濃度，并計算兩者比值。
　　 結(jié)果：
　　 1、供肝存活率：各組除供肝大

10、小外，在熱缺血時間、冷缺血時間、溫缺血時間、無肝期、肝下下腔靜脈阻斷時間、受體手術(shù)時間以及術(shù)中輸血量方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；小肝SST組供肝7d累積存活率高于小肝NS組(80％vs.42.9％)，但是差異仍缺少統(tǒng)計學(xué)意義，可能與實驗例數(shù)較少有關(guān)(P=0.1283＞0.05，Log-rank test)。
　　 2、肝腎功能變化：與小肝NS組比較，小肝SST組ALT、AST在術(shù)后1、2、3d顯著下降(P＜0.05)，TBIL在術(shù)后

11、1至7d顯著下降(P＜0.05)，PT同樣在術(shù)后1至5d顯著下降(P＜0.05)。術(shù)后肌酐水平各時間點兩組比較均無顯著性差異。
　　 3、光鏡下病理檢查：小肝NS組與全肝對照組比較，術(shù)后2h肝細(xì)胞腫脹變性壞死、肝竇擴(kuò)張淤血、門管區(qū)靜脈內(nèi)皮損傷、出血等均較嚴(yán)重，術(shù)后第3d大量肝細(xì)胞脂肪變，肝索增厚、壞死后纖維增生、匯管區(qū)擴(kuò)大及炎癥反應(yīng)均較明顯，術(shù)后第7d仍然存在肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂和肝細(xì)胞空泡樣變性，可見肝細(xì)胞增殖反應(yīng)；與小肝NS組比較

12、，小肝SST組各時間點的損傷、增殖及纖維化反應(yīng)均較輕，肝小葉結(jié)構(gòu)無明顯紊亂，炎癥反應(yīng)不明顯。
　　 4、電鏡下超微結(jié)構(gòu)檢查：小肝NS組與全肝對照組比較，術(shù)后2h肝細(xì)胞線粒體明顯腫脹，胞漿內(nèi)可見大量脂肪滴，細(xì)胞核有固縮反應(yīng)，肝竇淤血、竇內(nèi)皮破壞嚴(yán)重，Disse間隙消失并可見間隙內(nèi)出血；與小肝NS組比較，小肝SST組肝細(xì)胞變性輕微，線粒體輕度擴(kuò)張，肝竇結(jié)構(gòu)基本完整。
　　 5、PPG的變化：與全肝對照組比較，小肝NS組術(shù)后5

13、d內(nèi)各時間點PPG顯著升高(P＜0.05)，并于術(shù)后30min和1d達(dá)到峰值，至術(shù)后7d基本恢復(fù)，而小肝SST組較NS組顯著降低(P＜0.05)，術(shù)后5min達(dá)到峰值后逐步下降，術(shù)后第3d基本恢復(fù)，與全肝組比較，術(shù)后各時間點及術(shù)后2d仍顯著升高(P＜0.05)。
　　 6、肝再生情況：與全肝對照組比較，小肝NS組術(shù)后2h、3d、7d的Ki-67增殖指數(shù)均顯著升高(P＜0.05)，第7d的供肝增重率明顯升高(P＜0.05)；與小肝

14、NS組比較，小肝SST組術(shù)后2h和第3d的Ki-67增殖指數(shù)顯著下降(P＜0.05)，但術(shù)后第7d兩者無顯著性差異，且兩組供肝增重率比較亦無顯著性差異。
　　 7、凋亡指數(shù)：與全肝對照組比較，小肝NS組術(shù)后2h、3d、7d的凋亡指數(shù)均顯著升高(P＜0.05)；與小肝NS組比較，小肝SST組術(shù)后各時間點凋亡指數(shù)均顯著下降(P＜0.05)。
　　 8、肝內(nèi)ET-1轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平：與全肝對照組比較，小肝NS組術(shù)后2h ET-1

15、轉(zhuǎn)錄及第3d的蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P＜0.05)；與小肝NS組比較，小肝SST組術(shù)后2h ET-1轉(zhuǎn)錄及第3d的蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P＜0.05)。
　　 9、外周血ET-1/NO比值的變化：與全肝對照組比較，小肝NS組術(shù)后1、2、3d的ET/NO比值顯著升高(P＜0.05)；而小肝SST組術(shù)后除第1d顯著下降外，其余各時間點與全肝對照組無顯著性差異；與小肝NS組比較，小肝SST組術(shù)后1、2、3d的ET/NO比值顯著下降

16、(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、小體積肝移植術(shù)后早期持續(xù)升高的PPG和微循環(huán)障礙與小體積供肝損傷密切相關(guān)。
　　 2、小體積肝移植術(shù)后早期肝細(xì)胞的過度增殖對于小肝功能和體積的恢復(fù)并不是必需的，甚至可能存在負(fù)面效應(yīng)。
　　 3、SST-14可通過降低PPG、改善ET-1與NO介導(dǎo)的肝內(nèi)微循環(huán)功能紊亂及減少肝細(xì)胞凋亡來保護(hù)小體積供肝功能，改善供肝7d累積存活率。
　　 4、短期SST-14