鉀通道開放劑C15對(duì)KCNQ電流的影響.pdf

1、KCNQ基因編碼的離子通道屬于電壓依賴性鉀通道Kv7家族，目前發(fā)現(xiàn)KCNQ1～KCNQ5五個(gè)成員，其中KCNQ2和KCNQ5分別與KCNQ3形成的雜合體是構(gòu)成神經(jīng)系統(tǒng)M通道分子基礎(chǔ)，所記錄的電流稱為M樣電流(Im)，具有慢激活、非失活、電壓依賴特征，由于該通道在神經(jīng)閾電位附近開放，對(duì)神經(jīng)動(dòng)作電位的發(fā)放影響較大，尤其是在維持神經(jīng)細(xì)胞興奮性、靜息膜電位、突觸遞質(zhì)釋放等許多神經(jīng)活動(dòng)方面扮演重要的角色。而調(diào)節(jié)該類通道也成為治療癲癇、驚厥、病理性

2、神經(jīng)疼痛等多種神經(jīng)性疾病一個(gè)重要途徑。雙氯芬酸（Diclofenac）、氟吡汀(Flupirtine)作為非阿片類鎮(zhèn)痛藥能明顯增強(qiáng)KCNQ電流。瑞替加濱(Retigabine)是一個(gè)選擇性較高的KCNQ通道開放劑，可用于癲癇部分發(fā)作的輔助治療。
　　C15是經(jīng)高通量篩選發(fā)現(xiàn)的一個(gè)活性化合物，結(jié)構(gòu)比較新穎，對(duì)KNQ2/3通道有良好地開放活性。本文在此基礎(chǔ)上對(duì)C15調(diào)節(jié)KCNQ通道的特征、規(guī)律以及可能的機(jī)制進(jìn)行了探討，以期為開發(fā)成新藥

3、提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　目的:通過在表達(dá)系統(tǒng)和原代培養(yǎng)細(xì)胞上用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄KCNQ/M型電流，觀察化合物C15對(duì)KCNQ/M通道的調(diào)節(jié)特征和規(guī)律;利用電流鉗技術(shù)在原代培養(yǎng)的神經(jīng)元，背根神經(jīng)節(jié)(DRG)細(xì)胞上觀察C15對(duì)動(dòng)作電位的影響，分析C15對(duì)神經(jīng)興奮性的調(diào)節(jié)作用。
　　方法:
　　(1)通道表達(dá):利用分子生物學(xué)方法將KCNQ通道基因克隆在pcDNA3.0質(zhì)粒載體上，報(bào)告基因GFP克隆在pEGFP-N1質(zhì)

4、粒上，用TOP10感受態(tài)細(xì)菌轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增之后用試劑盒提取，并用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)鑒定質(zhì)粒的純度與濃度。在HEK293B細(xì)胞上，KCNQ2、KCNQ3及GFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，在倒置熒光顯微鏡上用450～490nm（藍(lán)光）激發(fā)觀察通道表達(dá)情況。
　　(2)電流記錄:利用Axon700B膜片鉗系統(tǒng)，在HEK293表達(dá)體系用兩性霉素B為打孔劑，全細(xì)胞電壓鉗方式記錄KCNQ電流;在原代培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元，以吸破的全細(xì)胞膜片鉗方式記錄M

5、電流，觀察化合物C15對(duì)KCNQ2/3電流和M電流的調(diào)節(jié)作用。
　　(3)動(dòng)作電位記錄:利用Axon700B膜片鉗系統(tǒng)，在DRG神經(jīng)元上用電流鉗的方式，記錄DRG神經(jīng)元膜電位和動(dòng)作電位，觀察C15和工具藥XE991對(duì)二者的影響。
　　結(jié)果:
　　(1)質(zhì)粒提取與鑒定結(jié)果:克隆在pcDNA3.0(5.4Kbp)載體上的KCNQ質(zhì)粒電泳條帶和綠色熒光蛋白pEGFP-N1(4.8Kbp)質(zhì)粒的電泳條帶均在5000bp左右。N

6、D-1000紫外/可見光分光光度計(jì)測(cè)得質(zhì)粒DNA的濃度值，其中KCNQ濃度均在200～500ng/μL之間，GFP均在200～500ng/μL之間;OD260/OD280值均在1.8～1.9之間。
　　(2)化合物C15濃度依賴性增強(qiáng)KCNQ2/3通道電流:當(dāng)給予10μmolC15引起KCNQ2/3通道激活電流和去活電流均明顯增大。繼而給予不同濃度的C15溶液(0.01μmol～60μmol)記錄，以濃度為橫坐標(biāo)，電流變化值為縱坐

7、標(biāo)，采用logistic方程進(jìn)行擬合，得到其量效關(guān)系曲線，半數(shù)有效量EC50為0.59±0.03μmol(n=8)。
　　(3)化合物C15可濃度依賴性增強(qiáng)KCNQ2/3通道激活電壓:將不同激活電壓下所得到的去活尾電流統(tǒng)一進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，擬合得到KCNQ2/3通道I-V曲線圖。給予0.04，0.2，1，5，20μmol不同濃度C15后，通道激活電壓逐漸向超極化方向移。以C15的濃度為橫坐標(biāo)，V1/2變化量為縱坐標(biāo)繪制的量效關(guān)系曲線，用

8、Boltzmann方程擬合，得EC50值為0.8±0.1μmol。
　　(4)化合物C15對(duì)KCNQ2/3通道動(dòng)力學(xué)特征的影響:用單指數(shù)方程對(duì)通道激活和去活電流擬合得到一個(gè)衡量通道開放快慢的時(shí)間參數(shù)(tau值，τ)，統(tǒng)計(jì)得到C15(20μmol)能顯著延長(zhǎng)通道激活和去活時(shí)間參數(shù)(P＜0.05，n=5)，。
　　(5)化合物C15對(duì)不同亞型KCNQ通道的選擇性:C15(1μmol)可不同程度增強(qiáng)KCNQ1，KCNQ2，KCNQ

9、4，KCNQ5，KCNQ2+3通道電流。并且使各通道激活曲線向超極化方向移動(dòng)。C15對(duì)KCNQ3通道作用不明顯，但對(duì)KCNQ2/3雜合通道影響較大。
　　C15對(duì)KCNQ通道動(dòng)力學(xué)影響，主要表現(xiàn):可延長(zhǎng)通道激活和去活時(shí)程，但對(duì)去活時(shí)間常數(shù)的影響比激活時(shí)間常數(shù)更明顯。尤其是對(duì)KCNQ1、KCNQ2和KCNQ2/3的影響最明顯。
　　(6)化合物C15對(duì)KCNQ2通道不同突變體的影響:C15(1μmol)對(duì)KCNQ2兩個(gè)突變體K

10、CNQ2(R207W)、KCNQ2(A306T)有明顯的調(diào)節(jié)作用，但對(duì)另外一種KCNQ2突變體(Y284C)的作用不明顯。其1μmol，10μmolC15對(duì)KCNQ2(Y284C)通道V1/2作用均不明顯。
　　(7) C15對(duì)大鼠背根神經(jīng)節(jié)上M電流的影響:記錄大鼠背根神經(jīng)元上的M電流。C15（10μmol）能夠顯著增加M電流21％(n=8)，但其作用要稍弱于對(duì)照藥RTG(P＞0.05，n=8)。C15還可以顯著性導(dǎo)致背根神經(jīng)元靜

11、息膜電位向超極化方向移動(dòng)。給予XE991后基本可以消除C15引起的細(xì)胞靜息膜電位變化。另一方面，C15可以減弱簇狀神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏谋l(fā)次數(shù)，顯著降低神經(jīng)元興奮性。
　　結(jié)論:
　　(1)C15能夠濃度依賴性增強(qiáng)KCNQ2/3電流，EC50為0.59±0.03μmol。C15使KCNQ2/3通道激活的I-V曲線向超極化電壓方向移動(dòng)，同時(shí)延長(zhǎng)激活和去活的時(shí)間常數(shù)，影響通道動(dòng)力學(xué)特征。
　　(2)C15對(duì)KCNQ1，KCNQ