ATP敏感鉀通道開放劑對Aβ1-42作用神經(jīng)元NR2B亞基蛋白表達影響的研究.pdf

1、研究目的:
　　阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)神經(jīng)功能障礙和變性、凋亡的起始因素及一系列分子細胞事件發(fā)生的具體機制目前仍未完全闡明，β-淀粉樣蛋白(β-amyloidpeptides，Aβ)沉積、氧化應激、高度磷酸化tau蛋白、Ca2+調(diào)節(jié)紊亂、能量代謝障礙以及被認為與AD發(fā)生有關(guān)。β-淀粉樣蛋白在腦內(nèi)的異常沉積是其特征性的病理學變化，其中Aβ1-42是最先沉淀且最難溶解，是細胞毒性作用較強的淀粉樣物

2、質(zhì)。Aβ細胞毒性作用的機制復雜，已有的研究證實Aβ能過度激活N-甲基-D-天（門）冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體，導致胞內(nèi)鈣超載，引起神經(jīng)變性和突觸功能障礙。NMDA受體是腦內(nèi)重要的離子型谷氨酸受體，在突觸間信號傳遞傳遞、長時程增強(long-term potentiation，LTP)等過程中發(fā)揮重要作用。NR2B是NMDA受體的調(diào)節(jié)亞單位，對NMDA受體的結(jié)構(gòu)和功能有十分重要的作用。NR2B亞基可調(diào)

3、節(jié)NMDA受體介導的興奮性突觸后電位，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸可塑性;同時含NR2B的NMDA受體離子通道對Ca2+表現(xiàn)出較高的通透性，是一個治療與NMDA受體相關(guān)疾病的潛在靶點。
　　ATP敏感性鉀離子通道(ATP-sensitive potassium channel，KATP)是存在細胞膜與線粒體內(nèi)膜的異源多聚體通道，通過感受細胞內(nèi)ATP/ADP水平的變化，將細胞代謝狀態(tài)與電活動偶聯(lián)在一起。近年來研究表明ATP敏感性鉀離子通道

4、的激活在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)病機制中發(fā)揮重要的神經(jīng)保護作用。已有研究發(fā)現(xiàn)線粒體KATP通道開放藥物二氮嗪(Diazoxide，DIZ)可明顯降低Aβ寡聚體聚集和Tau蛋白過度磷酸化，且能改善轉(zhuǎn)基因AD鼠模型的認知功能障礙;我們前期實驗已證實:二氮嗪預處理可改善Aβ1-42建立鼠模型的學習和記憶功能，并提高Bcl-2表達量，降低Caspase3的表達量，提示二氮嗪具有抗細胞凋亡作用，同時可逆轉(zhuǎn)Aβ1-42作用膽堿能神經(jīng)元導致的KATP通道亞基過

5、表達，抵抗Aβ1-42的神經(jīng)毒性，進一步研究發(fā)現(xiàn)信號通路NF-κB、p38MAPK、PKC均在其中發(fā)揮了重要作用。本研究旨在探討KATP通道開放劑二氮嗪對Aβ作用于原代培養(yǎng)神經(jīng)元NR2B亞基蛋白表達的影響，為探索AD新的靶向藥物提供基本理論依據(jù)。
　　研究方法:
　　本實驗采用細胞原代培養(yǎng)的方法，培養(yǎng)新生Wistar大乳鼠皮層和海馬神經(jīng)元。原代培養(yǎng)的神經(jīng)元進行爬片至第7d時，采用免疫熒光細胞化學的方法對皮層海馬神經(jīng)元NMDA

6、受體NR2B亞基蛋白的表達進行檢測。將培養(yǎng)至第7d的細胞隨機分為2個小組，每小組分4亞組。一個小組分組為:空白對照組、單純Aβ1-42(2μmol/L)干預組、Aβ1-42+二氮嗪干預組（Aβ1-42+DIZ干預組）、單純二氮嗪(50μmol/L)干預組。每組藥物干預方法:對照組加入等量的D-Hanks和培養(yǎng)液;單純Aβ1-42(2μmol/L)干預組:給予2μmol/L的Aβ1-42培養(yǎng);Aβ1-42+DIZ干預組:先用Diazoxi

7、de(DIZ)預處理培養(yǎng)神經(jīng)元1h，再加入2μmol/L的Aβ1-42培養(yǎng);單純二氮嗪(50μmol/L)干預組:加入Diazoxide(DIZ)預處理培養(yǎng)神經(jīng)元1h后，加入等量的D-Hanks和培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。將四個亞組藥物處理后分別培養(yǎng)24h和72h，采用Westernblot的方法分別檢測Aβ1-42和Diazoxide作用不同時間后細胞NR2B亞基蛋白表達水平的變化。另一小組的4個亞組分別用不同濃度(0、2μM、5μM、10μM

8、)的Aβ1-42作用原代培養(yǎng)神經(jīng)元，分別作用72h后，采用Westernblot的方法分別檢測Aβ1-42和Diazoxide作用不同時間后細胞NR2B亞基蛋白表達水平的變化。
　　研究結(jié)果:
　　(1).皮層及海馬神經(jīng)元免疫熒光染色結(jié)果顯示:藍色為DAPI染的細胞核，紅色為NR2B亞基蛋白，可以看出NR2B亞基在皮層及海馬神經(jīng)元胞膜的熒光強度值較高，樹突及軸突的熒光強度值也高但不如胞膜明顯，說明均有NR2B亞基在皮層及海馬

9、神經(jīng)元胞膜、樹突及軸突均有表達;
　　(2).單純Aβ1-42(2μmol/L)作用膽堿能神經(jīng)元24h后，NR2B亞基蛋白表達水平與對照組相比沒有明顯變化(p＞0.05）;二氮嗪(5μmol/L)預處理細胞1h后Aβ1-42(2μmol/L)共同作用24h，NR2B亞基蛋白表達較單純Aβ1-42干預組沒有明顯改變(p＞0.05)。
　　(3).通過應用不同濃度(0、2μM、5μM、10μM)的Aβ1-42作用原代培養(yǎng)神經(jīng)元7

10、2h后，可見隨著Aβ1-42作用濃度的不斷增高，NR2B亞基蛋白表達量呈濃度依賴性逐漸升高，并有統(tǒng)計學差異(p＜0.05）。
　　(4).單純Aβ1-42(2μmol/L)作用膽堿能神經(jīng)元72h后，NR2B亞基蛋白表達較對照組顯著升高(p＜0.05）;經(jīng)二氮嗪(50μmol/L)預處理細胞1h后，再與Aβ1-42(2μmol/L)共同作用72h，蛋白電泳顯示NR2B亞基蛋白表達較單純Aβ1-42干預組明顯降低(p＜0.05);單純

11、二氮嗪干預組NR2B亞基蛋白表達較對照組無明顯差異(p＞0.05）。
　　研究結(jié)論:
　　(1).原代培養(yǎng)的大腦皮層和海馬神經(jīng)細胞中，NR2B亞基在神經(jīng)元胞膜、樹突及軸突均有表達，且細胞膜表達量最高;
　　(2).Aβ1-42作用原代培養(yǎng)神經(jīng)元72h，能夠顯著增加神經(jīng)細胞NR2B亞基蛋白的表達量，同時ATP敏感鉀通道開放劑二氮嗪能拮抗Aβ1-42所引起的NR2B亞基蛋白表達量的升高，提示二氮嗪可能通過NMDA受體通路影