ATP敏感鉀通道開放劑對(duì)Aβ1-42作用神經(jīng)元NR2B亞基蛋白表達(dá)影響的研究.pdf

1、研究目的:
　　阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)神經(jīng)功能障礙和變性、凋亡的起始因素及一系列分子細(xì)胞事件發(fā)生的具體機(jī)制目前仍未完全闡明，β-淀粉樣蛋白(β-amyloidpeptides，Aβ)沉積、氧化應(yīng)激、高度磷酸化tau蛋白、Ca2+調(diào)節(jié)紊亂、能量代謝障礙以及被認(rèn)為與AD發(fā)生有關(guān)。β-淀粉樣蛋白在腦內(nèi)的異常沉積是其特征性的病理學(xué)變化，其中Aβ1-42是最先沉淀且最難溶解，是細(xì)胞毒性作用較強(qiáng)的淀粉樣物

2、質(zhì)。Aβ細(xì)胞毒性作用的機(jī)制復(fù)雜，已有的研究證實(shí)Aβ能過(guò)度激活N-甲基-D-天（門）冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體，導(dǎo)致胞內(nèi)鈣超載，引起神經(jīng)變性和突觸功能障礙。NMDA受體是腦內(nèi)重要的離子型谷氨酸受體，在突觸間信號(hào)傳遞傳遞、長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation，LTP)等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。NR2B是NMDA受體的調(diào)節(jié)亞單位，對(duì)NMDA受體的結(jié)構(gòu)和功能有十分重要的作用。NR2B亞基可調(diào)

3、節(jié)NMDA受體介導(dǎo)的興奮性突觸后電位，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸可塑性;同時(shí)含NR2B的NMDA受體離子通道對(duì)Ca2+表現(xiàn)出較高的通透性，是一個(gè)治療與NMDA受體相關(guān)疾病的潛在靶點(diǎn)。
　　ATP敏感性鉀離子通道(ATP-sensitive potassium channel，KATP)是存在細(xì)胞膜與線粒體內(nèi)膜的異源多聚體通道，通過(guò)感受細(xì)胞內(nèi)ATP/ADP水平的變化，將細(xì)胞代謝狀態(tài)與電活動(dòng)偶聯(lián)在一起。近年來(lái)研究表明ATP敏感性鉀離子通道

4、的激活在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要的神經(jīng)保護(hù)作用。已有研究發(fā)現(xiàn)線粒體KATP通道開放藥物二氮嗪(Diazoxide，DIZ)可明顯降低Aβ寡聚體聚集和Tau蛋白過(guò)度磷酸化，且能改善轉(zhuǎn)基因AD鼠模型的認(rèn)知功能障礙;我們前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí):二氮嗪預(yù)處理可改善Aβ1-42建立鼠模型的學(xué)習(xí)和記憶功能，并提高Bcl-2表達(dá)量，降低Caspase3的表達(dá)量，提示二氮嗪具有抗細(xì)胞凋亡作用，同時(shí)可逆轉(zhuǎn)Aβ1-42作用膽堿能神經(jīng)元導(dǎo)致的KATP通道亞基過(guò)

5、表達(dá)，抵抗Aβ1-42的神經(jīng)毒性，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)信號(hào)通路NF-κB、p38MAPK、PKC均在其中發(fā)揮了重要作用。本研究旨在探討KATP通道開放劑二氮嗪對(duì)Aβ作用于原代培養(yǎng)神經(jīng)元NR2B亞基蛋白表達(dá)的影響，為探索AD新的靶向藥物提供基本理論依據(jù)。
　　研究方法:
　　本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法，培養(yǎng)新生Wistar大乳鼠皮層和海馬神經(jīng)元。原代培養(yǎng)的神經(jīng)元進(jìn)行爬片至第7d時(shí)，采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的方法對(duì)皮層海馬神經(jīng)元NMDA

6、受體NR2B亞基蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。將培養(yǎng)至第7d的細(xì)胞隨機(jī)分為2個(gè)小組，每小組分4亞組。一個(gè)小組分組為:空白對(duì)照組、單純Aβ1-42(2μmol/L)干預(yù)組、Aβ1-42+二氮嗪干預(yù)組（Aβ1-42+DIZ干預(yù)組）、單純二氮嗪(50μmol/L)干預(yù)組。每組藥物干預(yù)方法:對(duì)照組加入等量的D-Hanks和培養(yǎng)液;單純Aβ1-42(2μmol/L)干預(yù)組:給予2μmol/L的Aβ1-42培養(yǎng);Aβ1-42+DIZ干預(yù)組:先用Diazoxi

7、de(DIZ)預(yù)處理培養(yǎng)神經(jīng)元1h，再加入2μmol/L的Aβ1-42培養(yǎng);單純二氮嗪(50μmol/L)干預(yù)組:加入Diazoxide(DIZ)預(yù)處理培養(yǎng)神經(jīng)元1h后，加入等量的D-Hanks和培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。將四個(gè)亞組藥物處理后分別培養(yǎng)24h和72h，采用Westernblot的方法分別檢測(cè)Aβ1-42和Diazoxide作用不同時(shí)間后細(xì)胞NR2B亞基蛋白表達(dá)水平的變化。另一小組的4個(gè)亞組分別用不同濃度(0、2μM、5μM、10μM

8、)的Aβ1-42作用原代培養(yǎng)神經(jīng)元，分別作用72h后，采用Westernblot的方法分別檢測(cè)Aβ1-42和Diazoxide作用不同時(shí)間后細(xì)胞NR2B亞基蛋白表達(dá)水平的變化。
　　研究結(jié)果:
　　(1).皮層及海馬神經(jīng)元免疫熒光染色結(jié)果顯示:藍(lán)色為DAPI染的細(xì)胞核，紅色為NR2B亞基蛋白，可以看出NR2B亞基在皮層及海馬神經(jīng)元胞膜的熒光強(qiáng)度值較高，樹突及軸突的熒光強(qiáng)度值也高但不如胞膜明顯，說(shuō)明均有NR2B亞基在皮層及海馬

9、神經(jīng)元胞膜、樹突及軸突均有表達(dá);
　　(2).單純Aβ1-42(2μmol/L)作用膽堿能神經(jīng)元24h后，NR2B亞基蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比沒有明顯變化(p＞0.05）;二氮嗪(5μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞1h后Aβ1-42(2μmol/L)共同作用24h，NR2B亞基蛋白表達(dá)較單純Aβ1-42干預(yù)組沒有明顯改變(p＞0.05)。
　　(3).通過(guò)應(yīng)用不同濃度(0、2μM、5μM、10μM)的Aβ1-42作用原代培養(yǎng)神經(jīng)元7

10、2h后，可見隨著Aβ1-42作用濃度的不斷增高，NR2B亞基蛋白表達(dá)量呈濃度依賴性逐漸升高，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05）。
　　(4).單純Aβ1-42(2μmol/L)作用膽堿能神經(jīng)元72h后，NR2B亞基蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著升高(p＜0.05）;經(jīng)二氮嗪(50μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞1h后，再與Aβ1-42(2μmol/L)共同作用72h，蛋白電泳顯示NR2B亞基蛋白表達(dá)較單純Aβ1-42干預(yù)組明顯降低(p＜0.05);單純

11、二氮嗪干預(yù)組NR2B亞基蛋白表達(dá)較對(duì)照組無(wú)明顯差異(p＞0.05）。
　　研究結(jié)論:
　　(1).原代培養(yǎng)的大腦皮層和海馬神經(jīng)細(xì)胞中，NR2B亞基在神經(jīng)元胞膜、樹突及軸突均有表達(dá)，且細(xì)胞膜表達(dá)量最高;
　　(2).Aβ1-42作用原代培養(yǎng)神經(jīng)元72h，能夠顯著增加神經(jīng)細(xì)胞NR2B亞基蛋白的表達(dá)量，同時(shí)ATP敏感鉀通道開放劑二氮嗪能拮抗Aβ1-42所引起的NR2B亞基蛋白表達(dá)量的升高，提示二氮嗪可能通過(guò)NMDA受體通路影