Humanin通過抑制NMDA受體NR1亞基表達(dá)增加和NR2B亞基磷酸化在興奮性神經(jīng)毒中發(fā)揮保護(hù)作用.pdf

1、目的：過量谷氨酸對(duì)NMDA受體的過度激活導(dǎo)致神經(jīng)元損傷直至死亡，稱之為興奮性神經(jīng)毒。興奮性神經(jīng)毒在多種神經(jīng)退行性疾病及各種神經(jīng)損傷(如缺血性損傷)過程中發(fā)揮重要作用。因此預(yù)防和拮抗NMDA受體過度激活引發(fā)的興奮性神經(jīng)毒是預(yù)防和治療各種神經(jīng)損傷和神經(jīng)疾病的重要靶點(diǎn)。NMDA受體是谷氨酸受體的一種亞型，屬于配體和電壓雙控的離子通道，由已知三類NR1、NR2、NR3家族基因編碼七種亞單位(NR1、NR2A-D、NR3A-B)組成四聚體復(fù)合物，

2、與細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白交互作用定位于神經(jīng)元突觸后膜致密區(qū)(PSD)。研究表明，NMDA受體的NR1、NR2B亞單位的選擇性表達(dá)、亞單位異聚體組成以及亞單位磷酸化狀態(tài)等均可影響NMDA受體的功能從而在興奮性神經(jīng)毒過程發(fā)揮重要作用。 Humanin(HN)最初由日本學(xué)者Hashimoto等在AD患者未受累及的枕葉獲得的一種由75bp開放讀碼框架(ORF)編碼的含24個(gè)氨基酸殘基的多肽。研究證實(shí)，HN能特異性的抑制家族性阿爾茨海默病(FAD

3、)基因突變及β一淀粉樣蛋白(Aβ)沉積等誘發(fā)的神經(jīng)元死亡，因而被命名為針對(duì)AD相關(guān)神經(jīng)毒性作用的特異性神經(jīng)保護(hù)肽。近期研究表明，HN亦可通過抑制BcL-2家族細(xì)胞前凋亡蛋白Bid、Bim、Bax而發(fā)揮保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)室前期研究也觀察到，HN對(duì)于缺血、缺氧及在NMDA誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒模型中引起的神經(jīng)元損傷發(fā)揮保護(hù)作用，表明HN可能具有廣泛的神經(jīng)保護(hù)作用。但HN拮抗NMDA受體發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制不清。因此本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)旨在觀察NMDA誘導(dǎo)

4、的興奮性神經(jīng)毒模型中，HN是否通過影響神經(jīng)元膜表面NMDA受體NR1亞單位蛋白表達(dá)的改變及NR2B亞單位的磷酸化水平而發(fā)揮其保護(hù)作用，以闡明HN發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制或作用途徑。 方法： 1、原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng) 取新生1-3DIV(day in vitro，DIV)的wi star大鼠大腦皮層組織，制成的細(xì)胞懸液種植于經(jīng)過L一多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板上，置于37℃下5％CO2的培養(yǎng)箱孵育至第9DIV按照實(shí)驗(yàn)

5、分組進(jìn)行試驗(yàn)。 2、實(shí)驗(yàn)分組 在培養(yǎng)8DIV的HN組神經(jīng)元培養(yǎng)液中加入HN，維持HN終濃度為1μmol/L。 (1)對(duì)照(Control)組：Locke’s液(無Mg2+) (2)NMDA組：NMDA(100μmol/L)+甘氨酸(10μmol/L) (3)MK-801組：NMDA(100μmol/L)+甘氨酸(10μmol/L)+MK-801(10μmol/L)(4)HN組：NMDA(100μm

6、ol/L)+甘氨酸(10μmol/L)+HN(1μmol/L) 3、檢測方法 (1)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測 神經(jīng)元膜表面NMDA受體NR1亞單位表達(dá)變化的形態(tài)學(xué)觀察 (2)流式細(xì)胞儀檢測 熒光定量檢測神經(jīng)元膜表面NMDA受體NR1亞單位蛋白表達(dá) (3)Western-blot 神經(jīng)元膜NMDA受體NR2B亞單位Tyr1472磷酸化水平的檢測 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 測定結(jié)果數(shù)據(jù)均

7、以x±s表示，運(yùn)用SPSS11.5軟件進(jìn)行單因素方差分析，方差齊者組間比較用LSD檢驗(yàn)，方差不齊組間比較用Games-Howell檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05，P<0.05表示有顯著性差異。 結(jié)果： 1、HN拮抗NMDA誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒 倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)的原代皮層神經(jīng)元呈橢圓形、折光性好，活性強(qiáng)，有明顯的神經(jīng)元之間突觸結(jié)構(gòu)的聯(lián)系；NMDA(100μmol/L)組的神經(jīng)元表現(xiàn)出明顯的毒性作用，包括神經(jīng)元的胞體腫脹

8、，突起較對(duì)照組明顯消失，呈現(xiàn)懸浮生長；MK一801(NMDA 100μmol/L+MK-801 10μmol/L)組的鏡下結(jié)果顯示，上述毒性作用基本消失，神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)與對(duì)照組相比無顯著差異，未發(fā)現(xiàn)明顯結(jié)構(gòu)改變；HN(NMDA100μmol/L+HN 1μmol/L)組的神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)與MK-801組結(jié)果相似，未發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性破壞的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果表明，HN對(duì)于NMDA誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用(形態(tài)結(jié)構(gòu)改變)具有抑制效應(yīng)。 2、

9、HN抑制NMDA誘導(dǎo)神經(jīng)元膜表面NMDA受體NR1亞單位蛋白表達(dá)的增加 (1)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測 與對(duì)照組相比，NMDA組中綠色熒光標(biāo)識(shí)的NMDA受體NR1亞單位蛋白在神經(jīng)元胞體兩極朝向突起的起始部位及核膜表面的表達(dá)顯著增加。與NMDA組比較，HN組和MK一801組綠色熒光標(biāo)識(shí)的NMDA受體NR1亞單位蛋白表達(dá)顯著減少。結(jié)果表明，NMDA可誘導(dǎo)神經(jīng)元膜表面NMDA受體NR1亞單位蛋白表達(dá)的增加，而HN可減弱由NMDA誘導(dǎo)的

10、神經(jīng)元膜表面NMDA受體NR1亞單位蛋白表達(dá)的增加。 (2)流式細(xì)胞儀熒光定量檢測 流式細(xì)胞儀的熒光定量檢測發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組NR1的平均熒光強(qiáng)度值為26.688±1.507，NMDA組NR1的平均熒光強(qiáng)度值為48.708±3.494，表明NMDA受體NR1亞單位蛋白在NMDA誘導(dǎo)下表達(dá)量明顯增加，兩者比較具有顯著性差異(p<0.05)；MK一801組NR1的平均熒光強(qiáng)度值為27.686±2.140，HN組NR1的平均熒光強(qiáng)度

11、值為29.74±3.288，兩者分別與NMDA組比較都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。上述結(jié)果表明，在NMDA和HN共同孵育2h的神經(jīng)元中，HN能抑制由NMDA誘導(dǎo)的NMDA受體NR1亞單位蛋白表達(dá)的增加，與免疫細(xì)胞化學(xué)檢測的定性檢測結(jié)果一致。 3、HN抑制NMDA誘導(dǎo)神經(jīng)元膜表面NMDA受體NR2B Tyr1472磷酸化水平的增強(qiáng) Western-blot結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)各組中，總NR2B亞單位蛋白表達(dá)水平?jīng)]有改變，而

12、NMDA組的NR2B Tyr1472磷酸化水平較對(duì)照組明顯升高(p<0.05)，HN組的NR2B Tyr1472磷酸化水平較NMDA組的明顯降低(p<0.05)。結(jié)果表明，NMDA可誘導(dǎo)NMDA受體NR2B Tyr1472磷酸化水平增強(qiáng)，而HN可降低NMDA誘導(dǎo)的NMDA受體NR2B Tyr1472磷酸化水平的增強(qiáng)。 結(jié)論： 1、NMDA誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元NMDA受體NR1亞單位表達(dá)增加，提示NMDA受體數(shù)量增加。