ATP敏感性鉀通道對缺氧條件下海馬CA1區(qū)神經(jīng)元保護作用及其機制的研究.pdf

1、背景對大部分的組織器官而言，氧是維持生命活動的必需因素。機體對缺氧的反應，缺氧耐受以及缺氧后的修復機制是國內(nèi)外生物學家和醫(yī)學家關注的課題。細胞對缺氧的反應可分為急性反應和慢性反應兩種。急性反應主要依賴于氧敏感的離子通道，而慢性反應主要依賴于缺氧誘導的轉錄因子(hypoxia-induciblefactor，HIF)對酶、生長因子以及轉運蛋白等表達的調(diào)節(jié)作用。慢性缺氧是很多疾病共同的病理過程，包括動脈粥樣硬化、糖尿病、彌漫間質性肺纖維化、

2、神經(jīng)退行性疾病、關節(jié)炎及老化。在細胞水平，缺氧能激活很多主要的信號轉導通路，誘導基因的表達，進而影響細胞的存活能力。這些被激活的信號轉導通路主要通過調(diào)節(jié)能影響基因表達的轉錄因子的活性發(fā)揮它們的作用。其中的一些通路能增強細胞的存活，另外的一些則導致細胞的死亡。 大腦是對缺氧最敏感的器官，它在缺氧狀態(tài)下的功能改變可以影響到全身的各個系統(tǒng)。ATP敏感性鉀通道是廣泛存在的一種離子通道，它分布于各種組織器官，如腦垂體、心肌、平滑肌、骨骼肌

3、和胰腺的β細胞，參與了多種細胞功能的調(diào)控，同時也涉及神經(jīng)元再生、死亡及細胞周期調(diào)控等過程。已有研究表明，在缺氧的情況下，ATP敏感性鉀通道有明顯的電生理方面的改變，并且KATP通道的激活對缺氧中的神經(jīng)元具有明顯的保護作用。然而，我們尚未清楚，在缺氧的狀態(tài)下，KATP通道的激活對神經(jīng)元保護作用的具體作用機制。因此，本研究是在離體培養(yǎng)海馬神經(jīng)元缺氧模型上研究細胞對惡劣環(huán)境因素的感知及其損傷信號在細胞內(nèi)的轉導，闡述損傷與適應的機制，有助于建立

4、預警—預防—診斷—治療一體的干預體系。 目的：在缺氧誘導的離體培養(yǎng)海馬神經(jīng)元凋亡模型上探討神經(jīng)元損傷可能的信號轉導機制，進一步闡明缺氧的病理生理過程，為神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)的缺血缺氧修復和治療，乃至腫瘤的治療提供新的策略。 方法：取出生1-2天SD大鼠，斷頭取腦，分離雙側海馬CA1區(qū)，機械分散細胞并制成單細胞懸液，細胞置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)一周后，將細胞分為兩大組：第一組為正常對照組，細胞在正常氧狀態(tài)中(5％CO2、

5、95％空氣)孵育12小時、24小時，除空白對照外，分別給予KATP通道的激動劑二氮嗪(100uM)，KATP通道的阻斷劑甲糖寧(100uM)，或用p53的阻斷劑曲古抑菌素trichostatin(TSA，25nM)預處理2h后再給予KATP通道的阻斷劑甲糖寧(100uM)；第二組為處理組，細胞在5％CO2、95％N2模擬的缺氧狀態(tài)孵育12小時、24小時，包含空白組，KATP通道激動劑二氮嗪處理組，KATP通道阻斷劑甲糖寧處理組，及曲古抑

6、菌素預處理組。運用Hoechst染色及MTT法比較常氧及缺氧狀態(tài)下，空白組及各個處理組對神經(jīng)元缺氧損傷的影響。運用RT-PCR方法比較不同處理組神經(jīng)元p53mRNA的表達情況。采用RT-PCR及免疫印記方法檢測KATP通道在常氧和缺氧條件下表達水平的差異。 結果：數(shù)據(jù)表明，在慢性重度缺氧中，p53的表達較正常氧分壓下明顯升高(p＜0.05)。在常氧組與缺氧組內(nèi)我們分別給予神經(jīng)元KATP通道的阻斷劑甲糖寧(100uM)和KATP通

7、道的激動劑二氮嗪(100uM)。結果顯示，在正常氧組，二者對p53mRNA表達水平的影響無顯著性差異；然而，在缺氧組，甲糖寧處理后，p53mRNA表達水平顯著增加(p＜0.05)，而二氮嗪處理后，p53mRNA水平較單純?nèi)毖踅M顯著降低(P＜0.05)，與正常組相比則無顯著差異(p＞0.05)。 在正常氧濃度培養(yǎng)條件下，神經(jīng)元中幾乎檢測不到DNA斷裂(正常培養(yǎng)12小時為2.2±1.3％，培養(yǎng)24小時為2.3±1.1％)，甲糖寧及二

8、氮嗪處理組亦對其無顯著影響(p＞0.05)。相反，在重度缺氧條件下，缺氧12小時后20.3±2.2％的神經(jīng)元出現(xiàn)細胞核損傷，缺氧24小時后31.6±1.7％的神經(jīng)元出現(xiàn)細胞核損傷。甲糖寧顯著增加神經(jīng)元細胞核損傷的比例(缺氧12小時為32.5±1.6％，缺氧24小時為45.7±3.4％)，而二氮嗪則減少細胞核損傷的比例(缺氧12小時為8.1±3.1％，缺氧24小時為18.4±2.3％)(p＜0.05，n=6)。 為了更好地說明KA

9、TP通道的保護作用是通過抑制p53的表達實現(xiàn)的，我們采用曲古抑菌素(TSA)預處理細胞2h。曲古抑菌素能特異性的阻斷缺氧誘導的依賴p53的凋亡途徑。結果顯示，曲古抑菌素能完全阻斷缺氧條件下甲糖寧的促凋亡作用，而對正常氧濃度下的神經(jīng)元無顯著影響。 MTT細胞活力檢測結果顯示，以正常氧濃度培養(yǎng)條件下神經(jīng)元的存活率為100％計算，甲糖寧及二氮嗪對正常氧培養(yǎng)神經(jīng)元的存活率無顯著影響(p＞0.05)。而在重度缺氧條件下，神經(jīng)元的存活率顯著

10、降低(缺氧12小時為78.44±5.43％，缺氧24小時為69.91±4.32％)，二氮嗪能提高神經(jīng)元的存活率(缺氧12小時為88.44±6.52％，缺氧24小時為82.67±3.79％)，而甲糖寧則減少神經(jīng)元的存活率，但甲糖寧的這種作用同樣可被曲古抑菌素(TSA)逆轉。 為了進一步了解KATP通道在缺氧中的作用，我們采用RT-PCR及免疫印記方法檢測KATP通道在常氧和缺氧條件下表達水平的差異。結果表明，KATP通道的SUR亞