利用RNA干擾技術抑制受磷蛋白基因表達治療慢性心力衰竭大鼠的研究.pdf

1、[背景]心力衰竭(heartfailure，HF)是各種心臟病的終末階段，其發(fā)病率、死亡率逐年增加，被稱為是心臟病最后的大戰(zhàn)場。研究發(fā)現(xiàn)心力衰竭時Ca2+穩(wěn)態(tài)紊亂，不僅影響心臟功能，也作為重要的信息遞質參與心肌重塑。受磷蛋白(phospholamban，PLN)與肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶(sarcoplasmicreticulumCa2+-ATPase，SERCA2a)是與Ca2+運轉有關的2種重要蛋白，SERCA2a將舒張期Ca2+重

2、吸收入肌漿網(wǎng)，促進心肌舒張。磷酸化的PLN可增加SERCA2a的活性，失磷酸化則抑制。心力衰竭時SERCA2a下降，而PLN無明顯降低，PLN/SERCA2a比值升高，對SERCA2a活性的抑制增強，導致心功能的惡化。 本研究利用新興的RNA干擾技術(RNAinterference，RNAi)，設計了表達PLN小發(fā)夾環(huán)狀RNA(shorthairpinRNA，shRNA)的重組腺相關病毒載體(adeno-associatedvi

3、rus，AAV)，轉導入心力衰竭大鼠體內，達到降解PLNmRNA，減少蛋白表達，增加PLN/SERCA2a比值，提高SERCA2a活性，改善心臟功能的目的。本研究共分三個部分進行論述。 [實驗第一部分] [目的]探索腹主動脈縮窄術后心衰大鼠模型的入選標準。 [方法]22只大鼠隨機分為3個月和6個月組，每組再分為假手術亞組(n=5)和手術亞組(n=6)。術后3個月，6個月時分別行超聲心動、血流動力學測定以及心肌病理

4、檢查。 [結果]3個月時，超聲檢查表明手術組大鼠左室舒張末徑(LVEDD)，左室收縮末徑(LVESD)增加，室間隔厚度(VSD)，左室后壁厚度(LVPWD)增厚，左室射血分數(shù)(EF)及短軸縮短率(FS)降低，但與假手術組比較無顯著差異(P＞0.05)。血流動力學指標平均動脈壓(MBP)，左室收縮壓(LVSP)，左室內壓最大上升及下降速率(LV±dp/dtmax)降低，心率(HR)，左室舒張末壓(LVEDP)增加，與假手術組比較也

5、無顯著差異(P＞0.05)。同期心肌病理切片可見心肌肥大，有點狀心肌壞死，但無成片壞死、纖維化；6個月時手術組大鼠超聲指標及血流動力學指標顯著惡化，較對照組有顯著差異(P＜0.05)，心肌病理檢查發(fā)現(xiàn)心肌細胞出現(xiàn)壞死，纖維化較明顯；同時我們測定了超聲指標與有創(chuàng)指標的相關性，LVESD，LVEDD，LVPWD、IVS與±dp/dtmax呈負相關，EF、FS呈正相關，其中EF、FS與+dp/dtmax的相關系數(shù)分別為0.86，0.83，與-

6、dp/dtmax的相關系數(shù)分別為0.85，0.81。 [結論]超聲診斷大鼠心力衰竭是可靠的，據(jù)此制定了心衰大鼠的入選標準：1.大鼠腹主動脈結扎術后6個月，出現(xiàn)進食量減少，精神萎，少活動，被毛無光澤、蓬松。2.超聲心動圖指標：LVESD＞0.55、LVEDD＞0.6，EF＜0.5，F(xiàn)S＜0.25。 [實驗第二部分] [目的]研究rAAV2介導表達的PLNshRNA對慢性心力衰竭大鼠的治療作用。 [方法]設計

7、了2條針對PLNmRNA不同位點的rAAV2-phRi1和rAAV2-phRi2。假手術組14只為對照組，56只心衰大鼠隨機分為4組：(1).HF組，即心衰組，大鼠心包腔內注射500μ1滅菌生理鹽水；(2).rAAV2攜帶綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescenceprotein，rAAV2-EGFP)組，心包腔內注射混合溶液500μ1(1×1011vgrAAV2-EGFP，0.7mg膠原酶，350μ透明質酸酶)；(

8、3).rAAV2-phRi1組，心包腔內注射500μl混合液(1×1011vgrAAV2-phRi1，0.7mg膠原酶，350μ透明質酸酶)；(4).rAAV2-phRi2組，心包腔內注射500μ1混合液(1×1011vgrAAV2-phRi2，0.7mg膠原酶，350μ透明質酸酶)。各組再隨機分為10天和30天亞組，每個亞組7只。采用經(jīng)腹心包腔內注射法將rAAV2-phRi導入心衰大鼠體內。導入后10天，30天進行血流動力學檢查，逆轉

9、錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)法、Western-b1ot印跡法測定PLN，SERCA2amRNA及蛋白質的表達，定磷法測定SERCA2a活性，冰凍切片觀察rAAV2-EGFP組心肌EGFP的表達判定轉導效果。 [結果]與對照組大鼠比較，心衰組血流動力學顯著惡化，PLNmRNA降低，蛋白量無明顯變化，SERCA2amRNA及蛋白顯著降低，SERCA2a活性也降低，與對照組比較均有顯著差異(P＜0.05)；rAAV2-phRi

10、導入10天時，與HF組及rAAV2-EGFP組大鼠比較，rAAV2-phRi1及rAAV2-phRi2組血流動力學稍有改善，PLNmRNA輕度降低，分別為18.76％/16.36％，蛋白量也輕度降低，但是無顯著差異(P＞0.05)，SERCA2amRNA及蛋白量，SERCA2a活性變化不大；導入30天時，與HF組大鼠比較，rAAV2-phRi1降低PLNmRNA達85.32％，rAAV2-phRi2降低了67.65％，相應地蛋白分別減少

11、了78.82％/59.33％，均有顯著差異(P＜0.05)；rAAV2-phRi1及rAAV2-phRi2組的SERCA2amRNA及蛋白變化不大，因此PLN/SERCA2a降低，SERCA2a的活性分別為HF組的2.04倍和1.74倍；血流動力學顯著改善(P＜0.05)；同時SERCA2a活性與PLN/SERCA2a，±dp/dtmax絕對值有很好的相關性；rAAV2-phRi1組±dp/dtmax絕對值的增加較rAAV2-phRi2

12、顯著(P＜0.05)；rAAV2-EGFP大鼠心肌冰凍切片可見彌漫綠色熒光蛋白表達。 [結論]經(jīng)腹心包腔內注射基因轉導是有效的；2種rAAV2-phRi均能有效地抑制PLNmRNA的表達，減少蛋白表達，降低PLN/SERCA2a，提高SERCA2a的活性，改善心臟功能，且rAAV2-phRi1優(yōu)于rAAV2-phRi2。 [實驗第三部分] [目的]研究rAAV2/1介導表達的PLNshRNA對慢性心力衰竭大鼠治療

13、作用的中長期效果及安全性。 [方法]構建表達PLNshRNA的rAAV2/1-phRi1。假手術組14只為對照組，21只心衰大鼠分為3組：(1).HF組，大鼠心包腔內注射混合液500μl(1×1011vgrAAV2-EGFP，0.7mg膠原酶，350μ透明質酸酶)；(2).rAAV2/1-phRi1低劑量組，大鼠心包腔內注射含有rAAV2/1-phRi1的混合液500μ1(1×1011vg，0.7mg膠原酶，350μ透明質酸酶)

14、；(3).rAAV2/1-phRi1高劑量組，大鼠心包腔內注射rAAV2/1-phRi1的混合液500μ1(2×1011vg，0.7mg膠原酶，350μ透明質酸酶)。各組再隨機分為30天，60天2個亞組，每個亞組7只。經(jīng)腹心包腔內注射法進行轉導。導入后30天，60天進行血流動力學檢查，RT-PCR法、Western-blot印跡法測定PLN，SERCA2amRNA及蛋白質的表達，定磷法測定SERCA2a活性，冰凍切片觀察rAAV2-EG