人眼脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞參與細(xì)胞外基質(zhì)重塑機(jī)制的研究.pdf

1、目的：葡萄膜—鞏膜細(xì)胞外基質(zhì)重塑機(jī)制在很多眼病研究中有重要意義，如前列腺素類藥物降眼壓機(jī)制、近視眼的形成機(jī)制等，都與眼局部信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控鞏膜基質(zhì)重塑有關(guān)。研究脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶的調(diào)控機(jī)制，及其對(duì)葡萄膜—鞏膜細(xì)胞外基質(zhì)重塑過程的影響，可以更好地理解脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞在眼球生長(zhǎng)調(diào)控中參與局部信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用機(jī)制。本研究的目的是利用體外培養(yǎng)人眼脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞，選擇與葡萄膜—鞏膜細(xì)胞外基質(zhì)重塑有關(guān)的兩種因子：前列腺素F2α與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)

2、因子β2作為刺激因子，觀察黑色素細(xì)胞表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑的變化。這個(gè)機(jī)制不但可以幫助我們更好地理解前列腺素F2α類藥物降低眼壓的機(jī)制，還有助于探索近視形成過程中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)重塑的過程。 材料和方法： 1.將人新鮮尸眼的脈絡(luò)膜組織用胰蛋白酶與膠原酶多次消化，分離得到的細(xì)胞用添加胎牛血清、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、異丁基甲基黃嘌呤、霍亂毒素的F12培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)、傳代、凍存和復(fù)蘇。用透射電鏡、細(xì)胞免

3、疫化學(xué)染色鑒定細(xì)胞性質(zhì)。 2.將體外培養(yǎng)的人眼脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、前列腺素F2α組、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2組。前列腺素F2α組的加入濃度分別為0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2組的加入濃度分別為0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml。使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)，細(xì)胞計(jì)數(shù)法和MTT法分別測(cè)定各組細(xì)胞的數(shù)目與活性。 3.將體外培養(yǎng)的人眼脈絡(luò)膜黑

4、色素細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、前列腺素F2α組、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2組，前列腺素F2α組的終濃度為10μg/ml，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2組的終濃度為1ng/ml。提取各組黑色素細(xì)胞總蛋白，采用WesternBlot印跡法從蛋白表達(dá)水平定量檢測(cè)各組脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞的基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑的表達(dá)，并用免疫熒光組化染色進(jìn)行定位。 結(jié)果：1.初分離的脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞呈棕色球狀體，24小時(shí)內(nèi)貼壁。貼壁細(xì)胞漸變?yōu)殡p極、三極或樹枝狀，常有較長(zhǎng)的分支，胞漿內(nèi)

5、含有棕黃色色素顆粒，傳代后色素量保持穩(wěn)定。電鏡下可見細(xì)胞表面有少量微絨毛，胞漿內(nèi)的黑素體沿胞膜分布或簇狀分布。體外培養(yǎng)的脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞對(duì)S-100抗體表達(dá)陽性，對(duì)細(xì)胞角蛋白抗體表達(dá)陰性。 2.體外培養(yǎng)的人眼脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞經(jīng)不同濃度前列腺素F2α處理后與對(duì)照組相比細(xì)胞形態(tài)改變不明顯，細(xì)胞數(shù)目與活性均無明顯改變(P＞0.05)；經(jīng)不同濃度轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2處理后與對(duì)照組相比細(xì)胞增殖不活躍，細(xì)胞數(shù)目減少、活性降低，且呈劑量依賴性，差

6、別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或0.01)。 3.用抗基質(zhì)金屬蛋白酶或其抑制劑的特異性抗體，進(jìn)行WesternBlot分析和免疫熒光組化標(biāo)記，結(jié)果顯示：體外培養(yǎng)的人眼脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞在未誘導(dǎo)條件下可表達(dá)低水平的基質(zhì)金屬蛋白酶-2；未見基質(zhì)金屬蛋白酶-1、3、9及組織金屬蛋白酶抑制劑-1、2的信號(hào)；經(jīng)前列腺素F2α處理后的脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞胞漿中可見明顯基質(zhì)金屬蛋白酶-1、2、3、9的陽性信號(hào)，其中以基質(zhì)金屬蛋白酶-1上調(diào)表達(dá)最明顯；

7、經(jīng)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2處理后的脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞胞漿中可見明顯基質(zhì)金屬蛋白酶-2、3、9的陽性信號(hào)，其中以基質(zhì)金屬蛋白酶-2上調(diào)表達(dá)最明顯。 結(jié)論：1.前列腺素F2α對(duì)體外培養(yǎng)的人眼脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)無明顯影響；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2可抑制體外培養(yǎng)人眼脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，且呈劑量依賴性。 2.體外培養(yǎng)的人眼脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞可表達(dá)部分類型的基質(zhì)金屬蛋白酶，不表達(dá)組織金屬蛋白酶抑制劑；前列腺素F2α可上調(diào)體外培養(yǎng)人眼脈絡(luò)

8、膜黑色素細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-1、2、3、9的表達(dá)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2可上調(diào)體外培養(yǎng)人眼脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-2、3、9的表達(dá)。 3.脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞在不同的信號(hào)因子調(diào)控下可以生成不同的基質(zhì)金屬蛋白酶譜，在不同的疾病發(fā)生機(jī)制中扮演相應(yīng)的角色。脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞可能通過參與葡萄膜—鞏膜細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶的調(diào)控過程，從而成為細(xì)胞工程學(xué)技術(shù)治療青光眼或近視眼的重要媒介。 第—章人眼脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定 目

9、的：觀察體外培養(yǎng)人眼脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，用透射電鏡、細(xì)胞免疫化學(xué)染色鑒定性質(zhì)，為進(jìn)一步研究脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞及相關(guān)眼病提供模型。材料和方法：將人新鮮尸眼的脈絡(luò)膜組織用胰蛋白酶與膠原酶多次消化，分離得到的細(xì)胞用添加胎牛血清、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、異丁基甲基黃嘌呤、霍亂毒素的F12培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)、傳代、凍存和復(fù)蘇。用透射電鏡、細(xì)胞免疫化學(xué)染色鑒定細(xì)胞性質(zhì)。 結(jié)果：初分離的脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞呈棕色球狀體，24小時(shí)內(nèi)貼壁。貼壁細(xì)胞

10、漸變?yōu)殡p極、三極或樹枝狀，常有較長(zhǎng)的分支，胞漿內(nèi)含有棕黃色色素顆粒，傳代后色素量保持穩(wěn)定。電鏡下可見細(xì)胞表面有少量微絨毛，胞漿內(nèi)的黑素體沿胞膜分布或簇狀分布。體外培養(yǎng)的脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞對(duì)S-100抗體表達(dá)陽性，對(duì)細(xì)胞角蛋白抗體表達(dá)陰性。 結(jié)論：采用胰蛋白酶與膠原酶多次消化并在培養(yǎng)液中添加多種刺激因子，可以建立人眼脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞的有限細(xì)胞系。 第二章PGF2α與TGF-β2對(duì)體外培養(yǎng)人眼脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的影響

11、 目的：觀察不同濃度PGF2α和TGF-β2刺激下，體外培養(yǎng)的人眼脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞數(shù)目與活性的變化，研究?jī)煞N因子對(duì)脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的影響。 材料和方法：將體外培養(yǎng)的人眼脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、前列腺素F2α組、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2組。前列腺素F2α組的加入濃度分別為0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2組的加入濃度分別為0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、1

12、00ng/ml。使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)，細(xì)胞計(jì)數(shù)法和MTT法分別測(cè)定各組細(xì)胞的數(shù)目與活性。 結(jié)果：體外培養(yǎng)的人眼脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞經(jīng)不同濃度前列腺素F2α處理后與對(duì)照組相比細(xì)胞形態(tài)改變不明顯，細(xì)胞數(shù)目與活性均無明顯改變(P＞0.05)；經(jīng)不同濃度轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2處理后與對(duì)照組相比細(xì)胞增殖不活躍，細(xì)胞數(shù)目減少、活性降低，且呈劑量依賴性，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或0.01)。 結(jié)論：前列腺素F2α對(duì)體外培養(yǎng)的人眼脈

13、絡(luò)膜黑色素細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)無明顯影響；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2可抑制體外培養(yǎng)人眼脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，且呈劑量依賴性。 第三章PGF2α與TGF-β2對(duì)人眼脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑表達(dá)影響的研究 目的：觀察體外培養(yǎng)人眼脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑的表達(dá)，以及PGF2α與TGF-β2對(duì)這種表達(dá)的影響，探討脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞的生理功能以及可能參與的兩個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 材料和方法：將體外培養(yǎng)的人眼

14、脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、前列腺素F2α組、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2組，前列腺素F2α組的終濃度為10μg/ml，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2組的終濃度為1ng/ml。提取各組黑色素細(xì)胞總蛋白，采用Western印跡法從蛋白表達(dá)水平定量檢測(cè)各組脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞的基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑的表達(dá)，并用免疫熒光組化技術(shù)進(jìn)行定位。 結(jié)果：用抗基質(zhì)金屬蛋白酶或其抑制劑的特異性抗體，進(jìn)行WesternBlot分析和免疫熒光組化標(biāo)記，結(jié)果顯示：體外培養(yǎng)的人

15、眼脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞在未誘導(dǎo)條件下可表達(dá)低水平的基質(zhì)金屬蛋白酶-2；未見基質(zhì)金屬蛋白酶-1、3、9及組織金屬蛋白酶抑制劑-1、2的信號(hào)；經(jīng)前列腺素F2α處理后的脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞胞漿中可見明顯基質(zhì)金屬蛋白酶-1、2、3、9的陽性信號(hào)，其中以基質(zhì)金屬蛋白酶-1上調(diào)表達(dá)最明顯；經(jīng)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2處理后的脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞胞漿中可見明顯基質(zhì)金屬蛋白酶-2、3、9的陽性信號(hào)，其中以基質(zhì)金屬蛋白酶-2上調(diào)表達(dá)最明顯。 結(jié)論：體外培養(yǎng)的人眼脈絡(luò)膜