抗氧化劑在梗阻性黃疸大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)氧化應(yīng)激損傷中的應(yīng)用研究.pdf

1、背景:梗阻性黃疸是指肝內(nèi)膽管或肝外膽管等膽道系統(tǒng)發(fā)生機(jī)械性梗阻時(shí)，膽紅素因膽汁向腸道的排泄受阻而返流入血所引起的黃疸。地卓西平馬來(lái)酸鹽（dizocilpinemaleate，MK-801）是一種非競(jìng)爭(zhēng)性NMDA受體拮抗劑，大量研究結(jié)果證實(shí)MK-801對(duì)中毒、缺血缺氧、肝性腦病等多種情況下的神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用。
　　白藜蘆醇(resveratrol，Res)是在葡萄和紅酒中大量存在的一種黃酮類(lèi)多酚化合物，大量的體內(nèi)和體外研究發(fā)現(xiàn)

2、它有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)和藥學(xué)活性作用，如抵御活性自由基對(duì)機(jī)體細(xì)胞DNA的損傷并且防止細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)等，并且已在心血管疾病、糖尿病、腎臟疾病等證實(shí)，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇所產(chǎn)生的藥理作用至少有部分是通過(guò)誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激損傷而進(jìn)一步產(chǎn)生細(xì)胞保護(hù)作用的。
　　本實(shí)驗(yàn)首先建立梗阻性黃疸大鼠模型，再通過(guò)觀察MK-801對(duì)梗阻性黃疸引起的大腦氧化應(yīng)激反應(yīng)中丙二醛(MDA)，總抗氧化能力(T-AOC)，超氧化物歧化酶(SOD)，

3、過(guò)氧化氫酶(CAT)，核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(transcription factor NF-E2-related factor2,Nrf2)蛋白，Nff2 mRNA,血紅素加氧酶-1（heineoxygenase-1，HO-1），NAD(P)H醌氧化還原酶1(NQO1，NAD(P)H quinone oxidoreductase1)等指標(biāo)的影響，進(jìn)而深入探討NMDA受體阻滯劑對(duì)梗阻性黃疸所致大腦氧化應(yīng)激損傷是否具有保護(hù)作用及其具體機(jī)

4、制。論文第三部分主要通過(guò)白藜蘆醇對(duì)梗阻性黃疸大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)MDA，SOD及HO-1研究其在氧化應(yīng)激損傷的過(guò)程中的作用。
　　第一部分 MK-801對(duì)梗阻性黃疸大鼠中樞神經(jīng)抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)的影響
　　目的:本部分研究的目的在于成功建立梗阻性黃疸大鼠模型，并探討MK-801對(duì)梗阻性黃疸大鼠中樞神經(jīng)抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)的影響。
　　方法:20只大鼠隨機(jī)分為四組:Ⅰ組（假手術(shù)組）、Ⅱ組（對(duì)照組）、Ⅲ組（低劑量處理組）和Ⅳ組（高劑量

5、處理組），Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ組為梗阻性黃疸模型組，Ⅲ，Ⅳ組為MK-801組。第2天起Ⅲ組腹腔注射MK-801，0.025mg/kg·d，Ⅳ組腹腔注射MK-801，0.25mg/kg·d;Ⅰ組和Ⅱ組以等容量生理鹽水同時(shí)注射。四組大鼠術(shù)后3d采尾部靜脈血以全自動(dòng)生化儀檢查血清總膽紅素和直接膽紅素濃度來(lái)確定模型制作是否成功，術(shù)后10天處死大鼠并取材（大腦皮質(zhì)）按試劑盒要求行MDA及CAT、T-SOD、T-AOC含量或活性測(cè)定。
　　結(jié)果:

6、>　　1.假手術(shù)組實(shí)驗(yàn)鼠術(shù)后當(dāng)日即恢復(fù)飲食及自由活動(dòng)，且活動(dòng)靈敏，小便淡黃。梗阻性黃疸模型組大鼠第2天開(kāi)始出現(xiàn)尾尖及耳部等皮膚較薄的部位黃染，并逐漸出現(xiàn)全身黃染，尿液深黃，精神萎靡、反應(yīng)遲緩。術(shù)后第三天，對(duì)照組、MK-801低劑量組、MK-801高劑量組大鼠大腦組織中直接膽紅素的濃度和總膽汁酸含量（μmol/L）與假手術(shù)組相比明顯增高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，考慮梗阻性黃疸模型制作成功。
　　2.對(duì)照組、MK-801低劑量

7、組、MK-801高劑量組丙二醛的含量與假手術(shù)組相比升高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。應(yīng)用MK-801后丙二醛含量與對(duì)照組相比降低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但MK-801高、低劑量組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　3.對(duì)照組氧化氫酶活性與假手術(shù)組相比降低，MK-801組過(guò)氧化氫酶活性比對(duì)照組明顯增高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。MK-801低劑量組、MK-801高劑量組之間過(guò)氧化氫酶活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)

8、　　4.對(duì)照組總超氧化物歧化酶活性比假手術(shù)組降低，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，MK-801組總超氧化物岐化酶活性與對(duì)照組相比明顯增高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。MK-801高劑量組總超氧化物岐化酶活性與低劑量組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　5.對(duì)照組、MK-801低劑量組、MK-801高劑量組總抗氧化能力與假手術(shù)組相比明顯增高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。MK-801組比對(duì)照組總抗氧化能力升高，但高劑量組與對(duì)照組之間相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞

9、0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.通過(guò)結(jié)扎實(shí)驗(yàn)動(dòng)物膽總管可以成功建立梗阻性黃疸動(dòng)物模型。
　　2.梗阻性黃疸時(shí)中樞神經(jīng)系統(tǒng)機(jī)體存在氧化應(yīng)激反應(yīng)，機(jī)體通過(guò)增加過(guò)氧化氫酶等抗氧化應(yīng)激損傷酶類(lèi)的表達(dá)使抗氧化應(yīng)激損傷能力增強(qiáng)，這與國(guó)內(nèi)外目前研究一致。
　　3.MK-801使梗阻性黃疸所致大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)氧化應(yīng)激損傷的過(guò)程中脂質(zhì)過(guò)氧化程度降低，并且可以提高SOD的活性及機(jī)體總抗氧化應(yīng)激能力，高劑量的MK-801與低劑量的M

10、K-801相比效果并未明顯增加，反而使T-SOD活性比低劑量組降低，具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。
　　第二部分 Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路在梗阻性黃疸大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)氧化應(yīng)激損傷中的作用探討
　　目的:研究Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路在梗阻性黃疸大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)氧化應(yīng)激損傷中的作用及在機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程中NMDA受體阻滯劑對(duì)Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路的影響
　　方法:四組大鼠分別為:Ⅰ組（假手

11、術(shù)組）、Ⅱ組（對(duì)照組）、Ⅲ組（低劑量處理組）和Ⅳ組（高劑量處理組），Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ組為梗阻性黃疸模型組，第2天起Ⅲ組腹腔注射MK-801，0.025mg/kg.d，Ⅳ組腹腔注射MK-801，0.25mg/kg.d，連續(xù)注射10d;Ⅰ組和Ⅱ組以等容量生理鹽水同時(shí)注射。術(shù)后10天取材以Western bolt行HO-1，NQO1，Nrf2蛋白，以RT-PCR行Nrf2 mRNA測(cè)定。
　　結(jié)果:
　　1.與假手術(shù)組相比，OJ組Nrf

12、2 mRNA表達(dá)均明顯升高，且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05。MK-801組與對(duì)照組相比Nrf2 mRNA表達(dá)升高且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。高劑量組與對(duì)照組相比Nrf2 mRNA表達(dá)降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞0.05。
　　2.與假手術(shù)組相比，OJ組Nrf2蛋白表達(dá)均增高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05; MK-801組與對(duì)照組相比Nrf2蛋白表達(dá)增高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。不同的是高劑量組與低劑量組相比Nrf2蛋白表達(dá)減

13、低，而且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。
　　3.OJ組與假手術(shù)組相比HO-1蛋白表達(dá)增高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。MK-801組與對(duì)照組相比HO-1蛋白表達(dá)增高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。高低劑量MK-801組比低劑量組相比，HO-1表達(dá)水平降低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P＜0.05。
　　4.OJ組與假手術(shù)組相比NQO1蛋白表達(dá)增高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。MK-801組與對(duì)照組相比NQ01蛋白表達(dá)增高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)

14、意義，P＜0.05。高低劑量MK-801組比低劑量組相比，NQO1表達(dá)水平降低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P＜0.05。
　　結(jié)論:
　　1.再一次驗(yàn)證梗阻性黃疸時(shí)機(jī)體存在氧化應(yīng)激反應(yīng)。
　　2.機(jī)體通過(guò)Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路增強(qiáng)了HO-1和NQO1及Nrf2蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)了自身抗氧化應(yīng)激能力。
　　3.NMDA受體阻滯劑MK-801通過(guò)Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路上調(diào)了Ⅱ相解毒酶HO-1和NQO-

15、1的蛋白表達(dá)，增加了機(jī)體抗氧化應(yīng)激反應(yīng)能力，從而發(fā)揮了它的神經(jīng)保護(hù)作用。雖然高、低劑量的MK-801均能達(dá)到此作用，但高劑量的MK-801反而使Nrf2 mRNA、Nrf2蛋白、HO-1和NQ01蛋白的表達(dá)較低劑量組降低，可能與MK-801毒性作用有關(guān)。
　　第三部分 不同水平白藜蘆醇對(duì)梗阻性黃疸大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)氧化應(yīng)激損傷的影響
　　目的:通過(guò)對(duì)研究梗阻性黃疸大鼠大腦皮質(zhì)中氧化應(yīng)激指標(biāo)表達(dá)水平來(lái)探討不同水平白藜蘆醇對(duì)梗阻性

16、黃疸大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)氧化應(yīng)激損傷的影響及其氧化應(yīng)激損傷中的保護(hù)作用和機(jī)制。
　　方法:選擇32只6周齡的雄性SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，將其隨機(jī)分為四個(gè)組別，分籠飼養(yǎng)，每組8只，A組大鼠進(jìn)行梗阻性黃疸假手術(shù)（只將膽總管游離出來(lái)，不做結(jié)扎），B、C、D組大鼠均進(jìn)行手術(shù)制備梗阻性黃疸模型，術(shù)后每日C、D兩組大鼠分別給予不同劑量的白藜蘆醇溶液灌胃，A、B組則給予同等劑量生理鹽水灌胃。分別在手術(shù)后的第14d采集血液標(biāo)本行總膽紅素、直接膽紅素、谷

17、丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定，并采集大腦皮質(zhì)標(biāo)本，并對(duì)其中中丙二醛、超氧化物歧化酶活性、HO-1水平進(jìn)行檢測(cè)，觀察不同組別的大鼠各項(xiàng)指標(biāo)之間的差異。
　　結(jié)果:術(shù)后TBIL及DBIL指標(biāo)結(jié)果證明Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ三組大鼠梗阻性黃疸模型制作成功。OJ組ALT、AST、MDA水平比假手術(shù)組升高，SOD、HO-1水平比假手術(shù)組降低。OJ組內(nèi)反應(yīng)肝功能損害指標(biāo)ALT，AST及反應(yīng)氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)MDA的平均水平呈Ⅱ＞Ⅲ＞Ⅳ的趨勢(shì)，而氧化應(yīng)激保護(hù)性指標(biāo)