黃連素改善內(nèi)皮微顆粒導(dǎo)致的內(nèi)皮細胞功能障礙的機制研究.pdf

1、內(nèi)皮細胞功能障礙(ECD)是心血管疾病的初期表現(xiàn)和主要標志。近年來，內(nèi)皮微顆粒(EMPs)被報道在許多心血管疾病可以引起內(nèi)皮功能障礙。氧化應(yīng)激在眾多心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。NADPH氧化酶(NOX)是血管壁活性氧類(ROS)的主要來源，NOX4是血管內(nèi)皮細胞上NADPH氧化酶的主要亞型，其激活過度表達可以引起ROS的產(chǎn)生增加。目前EMPs損傷內(nèi)皮細胞功能的機制尚未完全清楚，可能與其激活內(nèi)皮細胞上NOX4，導(dǎo)致ROS產(chǎn)生增

2、加有關(guān)。黃連素作為一種傳統(tǒng)中藥，已被證實可以通過增加血漿一氧化氮(NO)水平而上調(diào)循環(huán)內(nèi)皮祖細胞數(shù)量，可以通過增加NO的生物利用度而逆轉(zhuǎn)EMPs對內(nèi)皮細胞的功能損傷。黃連素是否通過抑制NADPH氧化酶的活性而改善EMPs導(dǎo)致的內(nèi)皮細胞功能障礙，目前尚未有研究報道。
　　 本研究主要探討EMPs損傷內(nèi)皮細胞，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞功能障礙的具體機制，以及黃連素對其損傷作用的影響及其機制，為臨床冠心病的治療提供實驗依據(jù)。主要內(nèi)容包括：①冠心病

3、及其高?；颊咧蠩MPs水平與內(nèi)皮舒張功能的關(guān)系的研究。②不同濃度EMPs刺激人臍靜脈內(nèi)皮細胞不同時間對ROS的產(chǎn)生的影響。③EMPs通過激活NADPH氧化酶導(dǎo)致內(nèi)皮細胞功能損傷。④黃連素對EMPs導(dǎo)致的HUVECs功能障礙的改善作用及其機制的研究。
　　 ㈠冠心病及其高?；颊咧蠩MPs水平與內(nèi)皮舒張功能的關(guān)系的研究。
　　 目的：在冠心病及其高?；颊咧醒芯縀MPs水平與血流介導(dǎo)的內(nèi)皮舒張功能之間的關(guān)系。
　　 方

4、法：選擇2009年3月～6月中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院高血壓血管病科住院的冠心病及高危患者各15例，記錄入院基礎(chǔ)資料，入院次晨空腹狀態(tài)下檢驗血生化指標及血樣中EMPs的濃度，檢測患者FMD水平以評價血流介導(dǎo)的內(nèi)皮舒張功能。
　　 結(jié)果：兩組患者的基線資料，除硝酸之類藥物的應(yīng)用有差別外，其他指標間均無統(tǒng)計學(xué)差異。冠心病患者EMPs水平高于高危因素患者，而FMD水平低于后者。在所有患者中，EMPs水平和FMD水平呈負相關(guān)，EMPs水平、F

5、MD水平與其他指標之間均無相關(guān)性。
　　 小結(jié)：冠心病患者中伴隨著EMPs水平的升高，F(xiàn)MD水平是減低的；EMPs水平和FMD水平間呈負相關(guān)；表明在冠心病患者中EMPs可以損傷血流介導(dǎo)的內(nèi)皮舒張功能。
　　 ㈡不同濃度EMPs刺激人臍靜脈內(nèi)皮細胞不同時間對ROS產(chǎn)生的影響。
　　 目的：觀察不同濃度EMPs與培養(yǎng)的HUVECs共同培養(yǎng)不同時間后產(chǎn)生ROS的變化。
　　 方法：采用臍帶注射胰蛋白酶法，分離培

6、養(yǎng)HUVECs，常規(guī)傳代、鑒定，取第3-6代人臍靜脈內(nèi)皮細胞用于實驗研究。采用饑餓法制備不同濃度(103～106/ml)的內(nèi)皮微顆粒，與培養(yǎng)的HUVECs共育不同時間(0～3h)，加入10μmol/l的DFCH-DA共育半小時后，用PBS洗去殘留的熒光染料，每組在熒光顯微鏡下隨機選擇6個不同的視野照相，然后使用Image J14.o分析熒光強度。所測得的熒光強度即代表產(chǎn)生ROS的量。
　　 結(jié)果：EMPs刺激HUVECs后，隨著

7、EMPs濃度的升高，ROS產(chǎn)生增多，1O5/ml EMPs已經(jīng)顯著升高ROS的產(chǎn)生；105/ml EMPs刺激HUVECs2h產(chǎn)生的ROS最多。
　　 小結(jié)：EMPs可以刺激HUVECs產(chǎn)生ROS增多，105/ml EMPs已經(jīng)顯著升高ROS的產(chǎn)生；EMPs刺激HUVECs2h對內(nèi)皮細胞的功能損傷作用最明顯；表明105/ml EMPs刺激HUVECs2小時可以通過增加ROS的產(chǎn)生而損害內(nèi)皮細胞功能。
　　 ㈢EMPs通過

8、激活NADPH氧化酶導(dǎo)致ROS產(chǎn)生增多。
　　 目的：探討EMPs損傷內(nèi)皮細胞功能的機制
　　 方法：采用臍帶注射胰蛋白酶法，分離培養(yǎng)HUVECs，常規(guī)傳代、鑒定，取第3-6代人臍靜脈內(nèi)皮細胞用于實驗研究。采用饑餓法制備105/ml EMPs，用20uMNADPH氧化酶抑制劑apocynin預(yù)處理30mins后再刺激HUVECs2h，觀察ROS產(chǎn)生的變化。實驗分為四組：(1)RPMI-1640培養(yǎng)基(n=6)；(2)RP

9、MI-1640培養(yǎng)基含有20μM apocynin(n=6)；(3)RPMI-1640培養(yǎng)基含有105/ml EMPs+20μMapocynin預(yù)處理0.5 h(n=6)；(4)RPMI-1640培養(yǎng)基含有105/ml EMPs(n=6)。
　　 結(jié)果：105/ml EMPs組ROS產(chǎn)生顯著高于RPMI-1640培養(yǎng)基對照組；20μM apocynin預(yù)處理能顯著抑制EMPs引起的ROS增多。
　　 小結(jié)：EMPs通過激

10、活NADPH氧化酶引起ROS產(chǎn)生增加，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞功能損傷。
　　 ㈣黃連素對EMPs導(dǎo)致的HUVECs功能障礙的改善作用及其機制的研究。
　　 目的：觀察NADPH氧化酶抑制劑apocynin及黃連素(berberine)對EMPs刺激HUVECs產(chǎn)生ROS、NO的影響以及NOX4蛋白表達的影響。
　　 方法：采用臍帶注射胰蛋白酶法，分離培養(yǎng)HUVECs，常規(guī)傳代、鑒定，取第3-6代人臍靜脈內(nèi)皮細胞用于實驗研究

11、。采用饑餓法制備105/ml EMPs刺激HUVECs2h，將HUVECs分成六組：(1)RPMI-1640培養(yǎng)基(n=6)；(2)含有20μMapocynin的RPMI-1640培養(yǎng)基(n=6)(3)含有105/ml EMPs的RPMI-1640培養(yǎng)基+20μM apocynin預(yù)處理0.5 h(n=6)(4)含有10μM黃連素的RPMI-1640培養(yǎng)基(n=6)(5)含有105/ml EMPs的RPMI-1640培養(yǎng)基+10μM黃連

12、素預(yù)處理0.5 h(n=6)；(6)含有105/ml EMPs的RPMI-1640培養(yǎng)基(n=6)；熒光顯微鏡檢測不同分組ROS的產(chǎn)生；間接法檢測不同分組NO的水平；Western blotting檢測不同分組NOX4蛋白表達。
　　 結(jié)果：單純RPMI-1640培養(yǎng)基組與apocynin組、黃連素組之間的ROS產(chǎn)生、NO水平、NOX4蛋白表達之間均無差異；105/ml EMPs顯著增加NOX4蛋白表達，同時引起ROS產(chǎn)生增加，

13、NO水平降低；apocynin、黃連素預(yù)處理都能顯著降低EMPs導(dǎo)致的NOX4蛋白表達增加以及抑制相應(yīng)的ROS產(chǎn)生增多、NO產(chǎn)生減少。
　　 小結(jié)：EMPs通過激活NOX4導(dǎo)致ROS產(chǎn)生增加，NO合成減少，黃連素可以通過抑制NOX4的激活而逆轉(zhuǎn)EMPs對HUVECs的損傷作用。
　　 總結(jié)：
　　 ⑴冠心病患者中EMPs可以損傷血流介導(dǎo)的內(nèi)皮舒張功能。
　　 ⑵105/ml EMP刺激HUVECs2h可以