瘦素受體及ssp411基因的生殖生物學(xué)功能研究.pdf

1、不孕不育作為一個(gè)普遍發(fā)生的疾病困擾著世界上約15％的夫婦，其中男方因素引起的不育約占50％。引起男性生育力下降的原因有很多，包括:生殖道感染，內(nèi)分泌紊亂，基因缺陷，免疫因素以及各種不良環(huán)境因素等，但是高達(dá)60-75％的患者找不到原因（特發(fā)性男性不育）。隨著遺傳機(jī)制研究的不斷深入及診斷技術(shù)的不斷改進(jìn)，更多的男性不育病因被找到。本研究主要從瘦素受體基因突變導(dǎo)致雄性不育的小鼠模型入手，探討瘦素受體突變對雄性生殖功能的影響;以及睪丸特異表達(dá)的新

2、基因ssp411在生育和不育男性患者精子中的表達(dá)變化，探討ssp411基因與男性不育的相關(guān)性。對男性/雄性生殖功能有影響的基因突變及缺失表達(dá)的研究有望為男性不育的臨床診斷和治療提供新的依據(jù)。
　　瘦素受體介導(dǎo)瘦素通路中一系列蛋白的表達(dá)從而調(diào)節(jié)整個(gè)機(jī)體的能量代謝、免疫反應(yīng)、血管生成以及生殖功能。Y123F小鼠模型是將瘦素受體蛋白的3個(gè)關(guān)鍵酪氨酸位點(diǎn)突變?yōu)楸奖彼?，結(jié)果突變后的小鼠表現(xiàn)為攝食過量、肥胖、脂肪肝和雄性不育。我們從Y123

3、F(-/-)雄性小鼠附睪尾獲取成熟精子，并與C57BL/6卵母細(xì)胞通過ICSI受精，體外培養(yǎng)至2細(xì)胞后移植到代孕ICR母鼠輸卵管，產(chǎn)生雜合子F1代，并通過F1代雜合子自交獲得不同基因型的F2代。結(jié)果通過ICSI技術(shù)我們獲得了31只F1代Y123F小鼠，其中20只存活，通過F1代自交我們得到了不同基因型的F2代小鼠。為研究Y123F(-/-)雄性小鼠的生殖功能，我們觀察其睪丸形態(tài)，附睪精子活動率，精子DNA損傷，以及精子體外受精能力。結(jié)果

4、發(fā)現(xiàn):Y123F(-/-)雄性睪丸和附睪均顯著小于野生型小鼠，盡管睪丸組織形態(tài)基本正常，但附睪精子則表現(xiàn)為活動率低和畸形率高， IVF受精率明顯低于正常和雜合子精子。我們進(jìn)一步用深度測序的方法比較了Y123F(-/-)小鼠與野生型小鼠精子的microRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)150個(gè)在精子中高豐度表達(dá)的microRNA中，超過40個(gè)miRNA在Y123F(-/-)小鼠精子中存在差異表達(dá)，這些miRNA是否與瘦素受體突變相關(guān)還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

5、r>　　ssp411基因是本實(shí)驗(yàn)室在大鼠睪丸中首次發(fā)現(xiàn)，其mRNA僅在大鼠睪丸生精細(xì)胞發(fā)生減數(shù)分裂后表達(dá)。而人ssp411基因則存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體，且在不同組織中異構(gòu)體的表達(dá)顯著差異，其中異構(gòu)體4和異構(gòu)體5僅在睪丸和精子細(xì)胞中表達(dá)。為研究人SSP411的功能，我們構(gòu)建了ssp411全基因表達(dá)質(zhì)粒，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的Western blot分析發(fā)現(xiàn)，僅ssp411異構(gòu)體5才表達(dá)SSP411蛋白。我們通過RT-PCR方法檢測了29例不育癥患者和正