2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、背景:抗菌肽是構成先天性免疫的重要組成物質。β-防御素是一種含有6個半胱氨酸殘基,前原肽由64個氨基酸構成的一種陽離子多肽。主要存在于動物的上皮組織中。防御素的成熟肽形式其分子量為3.5~6 kDa,富含精氨酸,富含陽離子。它可以對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和病毒等產生抑制作用。
  目的:尋找綿羊β-防御素-1(sBD-1)的活性區(qū)域且建立可以通過基因工程的方法得到有生物活性的、大量的、易純化的綿羊sBD-1的方法。
  

2、方法:含sBD-1信號肽序列的前原肽(psBD-1)和不含信號肽的sBD-1(msBD-1)在大腸桿菌 BL21(DE3)表達,而后將表達產物通過金屬螯合層析,腸激酶切,脫鹽和冷凍干燥后,將其作用于大腸桿菌。得到了sBD-1的活性區(qū)域msBD-1。而后又分別構建了Ppic9k-msBD-1和在其C末端加6個組氨酸標簽的Ppic9k-msBD-1-T的巴斯德畢赤酵母表達載體。進行了甲醇誘導表達,并對其表達的時間,培養(yǎng)基的pH,OD600和

3、甲醇的濃度進行了優(yōu)化,之后將其進行了大規(guī)模的發(fā)酵罐表達。將發(fā)酵后的發(fā)酵液進行了純化。而后 msBD-1和msBD-1-T進行了生物學功能鑒定。分別對大腸桿菌(Escherichia coli,E. coli) CMCC44101,金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus,S. aureus) CMCC26003,變形桿菌(Proteusbacillus vulgaris,P.vulgaris) CMCC49001,綠膿

4、桿菌(Pseudomonas aeruginosa,P. aeruginosa) CMCC10102,和痢疾桿菌(Shigella flexneri,S. flexneri) CMCC51285進行了抑菌圈的比較。并且進行了msBD-1和msBD-1-T對Hek293細胞中CCR6-CCL20通路的影響以及對Hek293細胞的趨化移動作了研究。
  結果:通過原核表達,得到了msBD-1為綿羊sBD-1的活性區(qū)域。而后在畢來酵母表

5、達,msBD-1和msBD-1-T在誘導24 h時,培養(yǎng)基pH為4.4,甲醇濃度為4%時它們的表達量最高。之而又進行了大規(guī)模的發(fā)酵罐表達。表達后Ppic9k-msBD-1-T通過金屬螯合層析,Sepdex-G10和冷凍干燥后獲得。而Ppic9k-msBD-1則通過不同pH的磷酸緩沖液-陽離子交換層析,分子篩和冷凍干燥獲得。之后進行了抑菌實驗,得到msBD-1和msBD-1-T對 E. coli,S. aureus,P. vulgaris

6、,P. aeruginosa和S. flexneri均有抑制作用。而在化學誘導實驗中,msBD-1和msBD-1-T均可使 Hek293細胞作定向移動,并且可誘導CCR6的表達量增加,而CCL20無變化。
  結論:
  1.蒙古綿羊β-防御素-1的抗菌活性是在細胞內經胞質內相關酶的加工后分泌到胞外發(fā)揮其生物學功能。
  2.成功構建了巴斯德畢赤酵母表達載體Ppic9k-msBD-1和Ppic9k-msBD-1-T,將

7、其轉入巴斯德畢赤酵母GS115中。并成功的將巴斯德畢赤酵母表達系統由搖瓶水平擴大至發(fā)酵罐水平,為進一步的進行大規(guī)模的生產奠定了基礎。
  3.建立了msBD-1和msBD-1-T的純化系統。尤其是msBD-1的純化,這為進一步大規(guī)模獲得成熟綿羊β-防御素-1提供了實驗室基礎。
  4. msBD-1和msBD-1-T均具有抑制細菌生長的作用,說明在防御素的C未端加6個HIS標簽對防御素抗菌作用沒有影響,由于HIS標簽是帶正電

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