蒙古綿羊β-防御素-1的表達、純化及生物學(xué)功能研究.pdf

1、背景：抗菌肽是構(gòu)成先天性免疫的重要組成物質(zhì)。β-防御素是一種含有6個半胱氨酸殘基，前原肽由64個氨基酸構(gòu)成的一種陽離子多肽。主要存在于動物的上皮組織中。防御素的成熟肽形式其分子量為3.5～6 kDa，富含精氨酸，富含陽離子。它可以對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和病毒等產(chǎn)生抑制作用。
　　目的：尋找綿羊β-防御素-1（sBD-1）的活性區(qū)域且建立可以通過基因工程的方法得到有生物活性的、大量的、易純化的綿羊sBD-1的方法。
　　

2、方法：含sBD-1信號肽序列的前原肽（psBD-1）和不含信號肽的sBD-1（msBD-1）在大腸桿菌 BL21(DE3)表達，而后將表達產(chǎn)物通過金屬螯合層析，腸激酶切，脫鹽和冷凍干燥后，將其作用于大腸桿菌。得到了sBD-1的活性區(qū)域msBD-1。而后又分別構(gòu)建了Ppic9k-msBD-1和在其C末端加6個組氨酸標(biāo)簽的Ppic9k-msBD-1-T的巴斯德畢赤酵母表達載體。進行了甲醇誘導(dǎo)表達，并對其表達的時間，培養(yǎng)基的pH，OD600和

3、甲醇的濃度進行了優(yōu)化，之后將其進行了大規(guī)模的發(fā)酵罐表達。將發(fā)酵后的發(fā)酵液進行了純化。而后 msBD-1和msBD-1-T進行了生物學(xué)功能鑒定。分別對大腸桿菌（Escherichia coli，E. coli) CMCC44101,金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus，S. aureus) CMCC26003,變形桿菌（Proteusbacillus vulgaris，P．vulgaris) CMCC49001,綠膿

4、桿菌（Pseudomonas aeruginosa，P. aeruginosa) CMCC10102,和痢疾桿菌（Shigella flexneri，S. flexneri) CMCC51285進行了抑菌圈的比較。并且進行了msBD-1和msBD-1-T對Hek293細(xì)胞中CCR6-CCL20通路的影響以及對Hek293細(xì)胞的趨化移動作了研究。
　　結(jié)果：通過原核表達，得到了msBD-1為綿羊sBD-1的活性區(qū)域。而后在畢來酵母表

5、達，msBD-1和msBD-1-T在誘導(dǎo)24 h時，培養(yǎng)基pH為4.4，甲醇濃度為4％時它們的表達量最高。之而又進行了大規(guī)模的發(fā)酵罐表達。表達后Ppic9k-msBD-1-T通過金屬螯合層析，Sepdex-G10和冷凍干燥后獲得。而Ppic9k-msBD-1則通過不同pH的磷酸緩沖液-陽離子交換層析，分子篩和冷凍干燥獲得。之后進行了抑菌實驗，得到msBD-1和msBD-1-T對 E. coli，S. aureus，P. vulgaris

6、，P. aeruginosa和S. flexneri均有抑制作用。而在化學(xué)誘導(dǎo)實驗中，msBD-1和msBD-1-T均可使 Hek293細(xì)胞作定向移動，并且可誘導(dǎo)CCR6的表達量增加，而CCL20無變化。
　　結(jié)論：
　　1.蒙古綿羊β-防御素-1的抗菌活性是在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)胞質(zhì)內(nèi)相關(guān)酶的加工后分泌到胞外發(fā)揮其生物學(xué)功能。
　　2.成功構(gòu)建了巴斯德畢赤酵母表達載體Ppic9k-msBD-1和Ppic9k-msBD-1-T，將

7、其轉(zhuǎn)入巴斯德畢赤酵母GS115中。并成功的將巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)由搖瓶水平擴大至發(fā)酵罐水平，為進一步的進行大規(guī)模的生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
　　3.建立了msBD-1和msBD-1-T的純化系統(tǒng)。尤其是msBD-1的純化，這為進一步大規(guī)模獲得成熟綿羊β-防御素-1提供了實驗室基礎(chǔ)。
　　4. msBD-1和msBD-1-T均具有抑制細(xì)菌生長的作用，說明在防御素的C未端加6個HIS標(biāo)簽對防御素抗菌作用沒有影響，由于HIS標(biāo)簽是帶正電