多氯聯(lián)苯與苯并芘聯(lián)合作用對(duì)機(jī)體損傷修復(fù)及遺傳穩(wěn)定的影響研究.pdf

1、多氯聯(lián)苯（polychlorinated biphenyls，PCBs）與苯并(a)芘（benzo(a)pyrene，BaP）作為兩種重要的污染物，因其在環(huán)境中廣泛存在并可對(duì)人體造成包括致癌、致突變?cè)趦?nèi)的多種有害效應(yīng)而備受關(guān)注。現(xiàn)有的研究證實(shí)，PCBs 在體內(nèi)可有效的促進(jìn)BaP的代謝活化，誘導(dǎo)后者轉(zhuǎn)化生成其終致癌物，從而在聯(lián)合作用時(shí)顯著增強(qiáng)BaP的遺傳毒性效應(yīng)。由于上述遺傳毒性終點(diǎn)效應(yīng)發(fā)生在機(jī)體中往往要經(jīng)過(guò)數(shù)十年的時(shí)間，且二者在環(huán)境中濃

2、度較低，因此目前經(jīng)毒理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)的PCBs 與BaP的有害效應(yīng)在普通人群中得到證實(shí)的報(bào)道極為少見(jiàn)。鑒于以上原因，探尋機(jī)體接觸PCBs 與BaP后產(chǎn)生的早期應(yīng)答事件，對(duì)于評(píng)價(jià)和預(yù)測(cè)這兩種重要環(huán)境污染物暴露所導(dǎo)致的健康危害意義重大。
　　 目的：各種環(huán)境有害因素經(jīng)過(guò)不同途徑作用于人體，在絕大多數(shù)情況下都會(huì)直接或間接地引起相應(yīng)基因的表達(dá)發(fā)生變化。和傳統(tǒng)的毒理學(xué)指標(biāo)相比，針對(duì)毒性相關(guān)的基因表達(dá)變化的研究能更敏感的反映環(huán)境因素的毒性特征。

3、本研究擬以基因表達(dá)譜芯片技術(shù)探討在PCBs 與BaP 聯(lián)合作用下重要基因功能通路的表達(dá)變化，以期發(fā)現(xiàn)對(duì)二者聯(lián)合暴露有重要意義的早期應(yīng)答基因。并以此為線索，對(duì)涉及DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期以及凋亡狀態(tài)的部分重要功能通路進(jìn)行深入的研究，從分子水平上揭示PCBs 與BaP 聯(lián)合作用的毒性作用機(jī)制，最終為二者聯(lián)合暴露所致健康危害的早期評(píng)價(jià)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：本文以HepG2 細(xì)胞為靶細(xì)胞，選擇PCBs的代表性同系物PCB126 與

4、PCB153為研究對(duì)象，設(shè)PCB126 劑量為1nmol/L，PCB153 劑量為10μmol/L，BaP 劑量為50μmol/L，以10 ml/L 二甲基亞砜（DMSO）為溶劑對(duì)照組，進(jìn)行各物質(zhì)的單獨(dú)染毒。同時(shí)以PCB126、PCB153 預(yù)處理HepG2 細(xì)胞48小時(shí)后，再與BaP 聯(lián)合染毒24小時(shí)。通過(guò)表達(dá)譜芯片技術(shù)檢測(cè)染毒后細(xì)胞相關(guān)功能基因的表達(dá)變化；根據(jù)芯片結(jié)果的提示，選擇PCB126 為PCBs受試物，設(shè)PCB126四個(gè)劑量

5、組（0.01、0.1、1、10nmol/L）、BaP 一個(gè)劑量組（50μmol/L），以DNA 損傷修復(fù)功能、細(xì)胞周期及凋亡狀態(tài)的變化為研究重點(diǎn)，探討二者聯(lián)合作用對(duì)重要功能通路的影響。以蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)染毒后細(xì)胞核苷酸切除修復(fù)通路上關(guān)鍵修復(fù)因子X(jué)PA、XPB、XPC的蛋白表達(dá)變化，同時(shí)引入BaP 代謝活化抑制劑ANF，在降低PCB126 與BaP 二者所導(dǎo)致的遺傳損傷后，進(jìn)一步探討聯(lián)合作用時(shí)DNA 損傷程度與修復(fù)通路功能狀態(tài)的聯(lián)系

6、；以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)染毒后細(xì)胞周期及凋亡狀態(tài)的變化，借此尋找PCB 與BaP 聯(lián)合暴露的早期效應(yīng)。為更深入認(rèn)識(shí)二者聯(lián)合暴露的毒作用終點(diǎn)和毒作用機(jī)制，以RNA 干擾技術(shù)建立芳烴受體低表達(dá)的細(xì)胞株，為后期研究芳烴受體在二者聯(lián)合毒作用中所發(fā)揮的關(guān)鍵作用提供技術(shù)支撐。
　　 結(jié)果：BaP 單獨(dú)作用時(shí)主要誘導(dǎo)DNA 損傷修復(fù)基因、細(xì)胞周期以及凋亡調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生變化，上述功能通路基因的表達(dá)變化總體上將有利于細(xì)胞維持自身的遺傳穩(wěn)定。PC

7、B126 與PCB153 單獨(dú)作用時(shí)可有效的誘導(dǎo)代謝酶相關(guān)基因的表達(dá)，且PCB126的誘導(dǎo)效應(yīng)明顯強(qiáng)于PCB153。PCBs 與BaP 聯(lián)合作用后對(duì)DNA損傷修復(fù)基因、周期以及凋亡調(diào)控基因的表達(dá)可產(chǎn)生復(fù)雜的不良影響，其誘導(dǎo)模式與BaP 單獨(dú)作用相比有較大的區(qū)別。PCB126和BaP 單獨(dú)作用均能有效的誘導(dǎo)修復(fù)因子X(jué)PA的表達(dá)上調(diào)，與溶劑對(duì)照比較，差異有顯著性（P＜0.01）。與BaP 單獨(dú)作用相比，除最低劑量以外，PCB126和BaP

8、聯(lián)合作用可明顯抑制修復(fù)因子X(jué)PA的蛋白表達(dá)（P＜0.01）。加入抑制劑ANF后，除PCB126 最高劑量與BaP 聯(lián)合作用可顯著抑制XPA的表達(dá)外（P＜0.05），其余所有劑量組的XPA表達(dá)量均恢復(fù)至溶劑對(duì)照DMSO 所誘導(dǎo)的水平。BaP 單獨(dú)作用可有效的抑制修復(fù)因子X(jué)PB的表達(dá)，與溶劑對(duì)照比較，差異有顯著性（P＜0.01）；PCB126 單獨(dú)作用可有效誘導(dǎo)修復(fù)因子X(jué)PB的表達(dá)量升高，在濃度為1nmol/l和10nmol/l 時(shí)差異有統(tǒng)

9、計(jì)學(xué)意義。與BaP 單獨(dú)作用相比，PCB126和BaP 聯(lián)合作用可有效的誘導(dǎo)修復(fù)因子X(jué)PB的蛋白表達(dá)（P＜0.01）。加入抑制劑ANF后，除PCB126 單獨(dú)作用在濃度為1nmol/l和10nmol/l的條件下仍可誘導(dǎo)修復(fù)因子X(jué)PB表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）外，其余所有劑量組的XPB表達(dá)量均恢復(fù)至溶劑對(duì)照DMSO 所誘導(dǎo)的水平。PCB126和BaP 單獨(dú)作用時(shí)對(duì)修復(fù)因子X(jué)PC的表達(dá)量均沒(méi)有明顯影響。與BaP 單獨(dú)作用相比，除最低劑量以外，

10、PCB126和BaP 聯(lián)合作用可明顯抑制修復(fù)因子X(jué)PC的蛋白表達(dá)（P＜0.01）。加入抑制劑ANF后，除PCB126 最高劑量與BaP 聯(lián)合作用可顯著抑制XPC的表達(dá)外（P＜0.05），其余所有劑量組的XPC表達(dá)量均恢復(fù)至溶劑對(duì)照DMSO 所誘導(dǎo)的水平。BaP 單獨(dú)作用可使細(xì)胞G1 期比例上升，同時(shí)使其S 期比例下降，與溶劑對(duì)照比較，差異有顯著性（P＜0.01）；PCB126 單獨(dú)作用可使細(xì)胞G1 期比例下降，而同時(shí)使G2 期比例上升，

11、與溶劑對(duì)照比較，差異有顯著性（P＜0.01）；與BaP單獨(dú)作用比較，PCB126和BaP 聯(lián)合作用可使細(xì)胞G1 期比例下降，二者聯(lián)合作用可使細(xì)胞S 期比例上升（P＜0.01）。BaP 單獨(dú)作用能有效的誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞發(fā)生凋亡，與溶劑對(duì)照比較，差異有顯著性（P＜0.01）；PCB126 單獨(dú)作用各劑量組均可有效的誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞發(fā)生凋亡，與溶劑對(duì)照比較，差異有顯著性（0.01 nmol/l 時(shí)P＜0.05，其余各組P＜0.01）；

12、與BaP 單獨(dú)作用比較，PCB和BaP 聯(lián)合作用可使HepG2 細(xì)胞凋亡率顯著上升（P＜0.01）。RNA 干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞（AhR(-)）的AhR蛋白的表達(dá)明顯低于正常細(xì)胞以及陰性對(duì)照細(xì)胞中的表達(dá)水平（P<0.05），與正常細(xì)胞比較AhR蛋白下降約18.3％。
　　 結(jié)論：（1）PCBs的存在干擾了機(jī)體針對(duì)BaP 所致?lián)p傷的有序應(yīng)答，可能涉及的機(jī)制包括抑制機(jī)體損傷修復(fù)能力、干擾細(xì)胞周期以及凋亡的調(diào)控。（2）上述三條機(jī)制的