多氯聯(lián)苯和苯并(a)芘聯(lián)合作用的遺傳毒性與代謝酶關(guān)系的研究.pdf

1、本文選擇了PCB153和PCB126這兩種PCBs作為研究對象，它們不但都屬于國際公約中要控制的12種POPs中的PCBs家族，而且又分別具有其代表性，論其危害性，PCB153是人體血液和乳汁中檢測到的最多的PCB之一，而PCB126是毒性最強的PCB之一；論其誘導(dǎo)代謝酶的模式，PCB153是PB誘導(dǎo)型，而PCB126是3-MC誘導(dǎo)型；論其化學(xué)結(jié)構(gòu)，PCB153是非共面結(jié)構(gòu)而PCB126是共面結(jié)構(gòu)。有研究表明，PCB126和PCB153

2、皆能誘導(dǎo)細(xì)胞色素P450酶活化[3-5]，而細(xì)胞色素P450酶在B(a)P等多環(huán)芳烴化合物由前致癌物代謝活化為終致癌物的過程中起著關(guān)鍵作用。因此，PCB153和PCB126有可能通過誘導(dǎo)代謝酶的活化從而增強B(a)P對機體的遺傳毒性，故我們采用PCBs和B(a)P聯(lián)合染毒的方式，探討環(huán)境中共存的這兩種污染物是否會比單獨存在造成更強的損傷，而毒性增強的途徑是否歸因于PCBs可誘導(dǎo)代謝酶這一特性從而對B(a)P的遺傳毒性造成影響。
　

3、　 本文通過體外培養(yǎng)來源于人類的代謝酶完全的肝腫瘤細(xì)胞株HepG2，采用熒光分光光度法、比色法、胞質(zhì)分裂阻滯法微核試驗和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)分別檢測HepG2細(xì)胞經(jīng)PCB153或PCB126預(yù)處理48h，再與B(a)P聯(lián)合染毒24小時后，其Ⅰ相代謝酶CYP1A1、CYP1A2、CYP2B以及II相代謝酶GST活性的變化、細(xì)胞中微核的生成、芳烴受體mRNA表達的改變，探討PCB126和PCB153對B(a)P致HepG2細(xì)胞遺傳損傷的影響

4、及其代謝酶機制，并通過加入P450酶抑制劑α-萘黃酮，驗證在PCBs和B(a)P聯(lián)合染毒的情況下，Ⅰ相代謝酶對遺傳毒性變化所起的作用。
　　 第一部分：
　　 設(shè)PCB153四個濃度組，B(a)P 50μmol/L濃度組，DMSO為溶劑對照。對靶細(xì)胞HepG2經(jīng)PCB153和B(a)P單獨染毒和PCB153處理48小時后再與B(a)P聯(lián)合染毒24小時，檢測各處理組HepG2細(xì)胞CYP1A1標(biāo)志酶EROD活性、CYP1A2

5、標(biāo)志酶MROD活性、CYP2B標(biāo)志酶PROD活性、GST活性、微核(MN)率和核分裂指數(shù)。并且加入Ⅰ相代謝酶抑制劑ANF后再次測定以上指標(biāo)，結(jié)果顯示：
　　 (一)ANF對PCB153單獨作用以及PCB153與B(a)P聯(lián)合作用所誘導(dǎo)的EROD、MROD和PROD的酶活性增加表現(xiàn)出抑制，對GST則表現(xiàn)出酶活性誘導(dǎo)增加。
　　 (二)析因設(shè)計的方差分析表明PCB153與B(a)P聯(lián)合作用時，對MN的誘導(dǎo)主要表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)。

6、加入ANF后，聯(lián)合作用下的微核率增加得到明顯的抑制，但在最高濃度的PCB153和B(a)P聯(lián)合作用條件下，微核率仍保持較高水平。
　　 綜上所述，PCB153和B(a)P在一定劑量水平上均能誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞Ⅰ相代謝酶CYP1A1、CYP1A2、CYP2B活性的增加，二者聯(lián)合作用對Ⅰ相代謝酶活性升高具有一定的協(xié)同效應(yīng)；PCB153能抑制Ⅱ相代謝酶GST的活性，PCB153和B(a)P聯(lián)合作用對GST的誘導(dǎo)呈現(xiàn)拮抗效應(yīng)；除最高濃度

7、外，其余濃度的PCB153對HepG2細(xì)胞MN的生成無顯著影響，PCB153和B(a)P聯(lián)合作用則對MN的誘導(dǎo)呈現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)。加入ANF后對Ⅰ相代謝酶的抑制和對Ⅱ相代謝酶的增強，以及對微核率的抑制，驗證了在PCB153和B(a)P聯(lián)合作用的模式下，B(a)P被代謝活化遺傳毒性得以增強的過程中，PCB153對代謝酶所起的關(guān)鍵性調(diào)控作用。
　　 第二部分：
　　 設(shè)PCB126四個濃度組(0.01、0.1、1、10nmol/L

8、)，B(a)P 50μmol/L濃度組，DMSO(10ml/L)為溶劑對照。對靶細(xì)胞HepG2經(jīng)PCB126和B(a)P單獨染毒和PCB126處理48小時后再與B(a)P聯(lián)合染毒24小時，檢測各處理組HepG2細(xì)胞CYP1A1標(biāo)志酶EROD活性、CYP1A2標(biāo)志酶MROD活性、CYP2B標(biāo)志酶PROD活性、GST活性、微核率和NDI。并且加入Ⅰ相代謝酶抑制劑ANF后再次測定以上指標(biāo)，結(jié)果顯示：
　　 (一)ANF對PCB126單

9、獨作用以及PCB126與B(a)P聯(lián)合作用誘導(dǎo)的EROD、MROD和PROD的酶活性增加表現(xiàn)出抑制，對GST則表現(xiàn)出酶活性誘導(dǎo)增加。
　　 (二)50μmol/L的B(a)P和0.01、0.1、1、10nmol/L的PCB126誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞微核率分別為52±6.00‰、22±8.14‰、30±10.5‰、35±7.76‰和36±6.50‰，與DMSO溶劑對照(23±3.05‰)相比，除B(a)P能顯著誘導(dǎo)微核率增加外，其

10、余濃度的PCB126均無誘導(dǎo)MN增加的作用，對NDI也無顯著影響；經(jīng)0.01、0.1、1、10nmol/L的PCB126預(yù)處理再與B(a)P聯(lián)合染毒后，其微核率分別為52±4.51‰、73±5.51‰、79±4.24‰和86±2.00‰，后三者較B(a)P單獨作用誘導(dǎo)的MN(52±6.00‰)增高了21[％]、27[％]和34[％]，且差異有顯著性意義(P＜0.05)。析因設(shè)計的方差分析表明PCB126與B(a)P聯(lián)合作用時，其交互作用

11、主要表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)。加入ANF后聯(lián)合作用組的微核率得到了明顯的抑制。
　　 綜上所述，PCB126和B(a)P在一定劑量水平上均能誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞Ⅰ相代謝酶CYP1A1、CYP1A2、CYP2B活性的增加，PCB126則能抑制Ⅱ相代謝酶GST的活性。PCB126與B(a)P聯(lián)合作用對代謝酶的影響，因PCB126的濃度而呈現(xiàn)多樣化，總趨勢是：對CYP1A1、CYP1A2和GST的影響主要表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)，對CYP2B的影響主要表現(xiàn)

12、為拮抗效應(yīng)。受試濃度下的PCB126無誘導(dǎo)微核率增高的作用，PCB126與B(a)P聯(lián)合作用對MN的誘導(dǎo)呈現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)。加入抑制劑ANF后抑制了Ⅰ相代謝酶的活性，增強了Ⅱ相代謝酶的活性，并使微核率下降，驗證了在PCB126和B(a)P聯(lián)合作用的模式下，B(a)P被代謝活化遺傳毒性得以增強的過程中，PCB126對代謝酶所起的關(guān)鍵性調(diào)控作用。
　　 第三部分：
　　 設(shè)PCB126四個濃度組，B(a)P 50μmol/L濃度

13、組，DMSO為溶劑對照。采用對靶細(xì)胞HepG2經(jīng)PCB126處理48小時后再聯(lián)合染毒B(a)P 24小時的方式，運用RT-PCR法檢測各處理組HepG2細(xì)胞Ah受體mRNA表達的變化。結(jié)果顯示B(a)P處理組和PCB126四個濃度的Ah受體的mRNA光密度比值明顯增高；經(jīng)各濃度PCB126與B(a)P聯(lián)合染毒后，異具有顯著性。加入ANF后Ah受體mRNA表達明顯下降，與DMSO溶劑對照相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，P

14、CB126與B(a)P聯(lián)合作用時CYP1A1和CYP1A2的活性與Ah受體mRNA的表達呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.838和0.900；而Ah受體mRNA的表達與微核率也呈現(xiàn)正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)為0.899，故可推測由Ah受體介導(dǎo)的Ⅰ相代謝酶活性增高對微核率的增加有明顯的影響，提示Ah受體在PCB126和B(a)P聯(lián)合作用產(chǎn)生的協(xié)同效應(yīng)中不可替代的作用。
　　 綜上所述，PCB126和B(a)P在一定劑量水平上均能誘導(dǎo)HepG2細(xì)

15、胞Ah受體mRNA的表達增加，二者聯(lián)合作用對Ah受體的誘導(dǎo)主要表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)。由于PCB126屬3-MC代謝酶誘導(dǎo)類型，Ah受體通路是其誘導(dǎo)代謝酶的主要通路，作為Ah受體高親力的配體，PCB126能通過影響Ah受體增加Ⅰ相代謝酶的活性從而增強B(a)P的遺傳毒性。
　　 主要結(jié)論：
　　 1．PCBs能誘導(dǎo)Ⅰ相代謝酶，抑制Ⅱ相代謝酶，通過改變代謝酶的活性，使B(a)P的遺傳毒性明顯增強；
　　 2．作為非共面結(jié)構(gòu)

16、的PCB，PCB153對B(a)P遺傳毒性增強的具體機制雖然還不是很清楚，但顯而易見與Ⅰ、Ⅱ相代謝酶活性的改變有很重要的關(guān)系；
　　 3．作為共面結(jié)構(gòu)的PCB，PCB126對B(a)P遺傳毒性的增強主要是通過與Ah受體結(jié)合，促進Ⅰ相代謝酶合成增加的途徑而實現(xiàn)，證實了Ⅰ相代謝酶在PCBs對B(a)P遺傳毒性起協(xié)同效應(yīng)時的關(guān)鍵作用。
　　 創(chuàng)新點：
　　 1．首次將兩種有代表性的PCBs和B(a)P在哺乳動物細(xì)胞中進