Dicer切割7SL RNA及其切割產(chǎn)物的初步功能研究.pdf

1、目的:已有研究表明，Dicer表達(dá)下調(diào)能夠?qū)е翧lu序列在人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中累積。此外，Dicer還可能將嚙齒類動(dòng)物的內(nèi)源性SINE/B1 RNA（相當(dāng)于靈長類動(dòng)物的Alu序列）切割成小干擾RNA(siRNA)。Alu的產(chǎn)生源于7SL RNA（一個(gè)信號識別顆粒的組分），本課題旨在研究Dicer是否可以切割A(yù)lu序列及7SL RNA。
　　 方法:
　　 (1)利用Solexa深度測序技術(shù)，分析Dicer敲除和對照組H

2、epG2.2.15細(xì)胞的小RNA，探究Dicer是否可以切割A(yù)lu序列;運(yùn)用BLAST和SOAP2軟件將小RNA測序結(jié)果與人的7SL RNA序列進(jìn)行比對，分析Dicer是否可以切割7SL RNA;使用人類重組Dicer蛋白對7SL RNA進(jìn)行體外切割，研究Dicer能否切割7SLRNA。
　　 (2) Northern blot驗(yàn)證Dicer切割7SL RNA生成小分子RNA。
　　 (3)構(gòu)建7SL RNA的小RNA切

3、割產(chǎn)物(7SL sRNA5cd和7SL sRNA8b)的熒光素酶報(bào)告基因載體，在HepG2.2.15和HEK293T細(xì)胞中分別進(jìn)行熒光素酶活性檢測，分析這兩個(gè)小分子RNA與miRNA的功能是否相同。
　　 (4)運(yùn)用RNA免疫共沉淀技術(shù)，研究7SL RNA產(chǎn)生的小分子RNA是否能與Argonaute蛋白結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)。
　　 (5)在HepG2.2.15和HEK293T細(xì)胞中先過表達(dá)7SL s

4、RNA5cd或7SL sRNA8b，然后運(yùn)用ChIP及實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)研究7SL RNA產(chǎn)生的小分子RNA是否能調(diào)節(jié)7SL RNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 (1)在敲除Dicer的細(xì)胞中，源于Alu序列的小分子RNA顯著減少，表明Dicer在HepG2.2.15細(xì)胞中能夠切割A(yù)lu序列。
　　 (2)小RNA測序結(jié)果表明Dicer能夠?qū)?SL RNA切割成不同長度的片段(18-23nt)，片段主要富集

5、于兩個(gè)區(qū)域，分別命名為7SL sRNA5cd和7SLsRNA8b。Northern-blot證實(shí)7SL RNA可被Dicer切割。
　　 (3)7SL RNA來源的小分子RNA(7SL sRNA5cd，7SL sRNA8b)與miRNA(如miR-31)的功能不類似。
　　 (4)7SL sRNA5cd和7SL sRNA8b均不能調(diào)節(jié)7SL RNA表達(dá)。
　　 結(jié)論:7SL RNA可以被Dicer切割成不同長度的