P53RNA干擾系統(tǒng)的構建及其初步功能研究.pdf

1、p53基因是一種非常重要的抑癌基因,人類p53基因位于17號染色體的短臂上(17p13.1),現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)它在細胞周期調控、抑制細胞生長、誘導腫瘤細胞凋亡等方面有重要的作用.p53基因的突變和缺失,是許多腫瘤發(fā)生的重要原因之一.p53基因不僅與腫瘤的發(fā)生有著密切關系,而且與腫瘤血管調控、腫瘤細胞對放療和化療的敏感性等方面有著重要聯(lián)系.p53基因的這些生物學效應主要通過激活或抑制大量下游基因的表達來完成,但p53與多種基因之間存在的具體調節(jié)機

2、制尚不明確. 在功能基因組研究中,需要對特定基因進行功能喪失或突變.以確定其功能或與其它基因之間的聯(lián)系.RNA干擾(RNA interfererme,RNAi)是近幾年發(fā)展起來的一種特異的靶基因失活技術,它通過小的雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)高效、特異的阻斷體內(nèi)特定基因的表達,促使mRNA降解,誘使細胞出現(xiàn)缺失特定基因表型的過程.由于RNAi高度的序列專一性,可以特異地使特定基因沉默,在眾多有機體中,

3、雙鏈RNA能觸發(fā)轉錄后基因沉默,因而成為敲除特定基因在哺乳動物細胞系中表達的有力工具. 在哺乳動物中通過RNAi機制實現(xiàn)基因表達的抑制有多種策略,其中以構建siRNA(small intereference RNA)表達載體的方法最為穩(wěn)定和持久.本研究特異性針對p53基因來設計并構建能抑制此基因的RNA干擾載體,把干擾載體穩(wěn)定轉染入胃癌細胞SGC-7901,從基因水平和蛋白水平檢測此干擾載體的抑制效率,并觀察抑制p53基因的表達

4、對胃癌細胞SGC-7901的生長影響.根據(jù)文獻p53SiRNA序列<'[3]>,設計并化學合成2段編碼短發(fā)夾RNA序列的、靶向p53基因的寡核苷酸,退火,克隆到經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶酶切后的siRNA表達載體--pSIIPER-EGFPl(pSG)啟動子的下游,重組構建RNAi質粒,同時設立非特異性對照,干擾載體用限制性核酸內(nèi)切酶酶切和測序鑒定,構建好的干擾載體轉染胃癌細胞SGC-7901,用G418篩選建立穩(wěn)定細胞系,通過RT-PCR和W

5、estern blot檢測其對p53基因的抑制效果,并利用流式細胞儀檢測細胞生長周期和作細胞生長曲線的方法觀察抑制p53基因的表達對胃癌細胞SGC-7901的生長影響. 結果 經(jīng)HindⅢ和EcoR I雙酶切電泳分析以及插入基因的序列分析證實:我們設計的堿基序列成功插入到了預計位點,一個特異性針對p53基因的干擾載體pSiJPER-EGFPl-p53i(pSG-p53i)構建成功.同時,我們也構建了一個非特異性干擾載體p

6、SIJPER-EGFPl-p53c(pSG-p53c)作為對照. 分別將pSG-p53i和IpSG-p53c轉染入胃癌細胞SGC-7901建立穩(wěn)定細胞系,用RT-PCR檢測p53基因mRNA表達變化,其結果顯示:轉染了pSG-p53i的胃癌細胞其p53mRNA的表達水平顯著低于非特異對照,經(jīng)BandScan V5.0軟件分析得到mRNA表達的抑制率為62﹪:用Western blot檢測p53基因蛋白表達變化,其結果表明:轉染了

7、pSG-p53i的胃癌細胞其p53基因蛋白表達量顯著低于非特異對照. 利用流式細胞儀檢測細胞生長周期,其結果為:轉染了pSG-p53i的胃癌細胞相比對照細胞其Gl期細胞減少了24.2﹪,S期細胞增加了81.0﹪,G2期細胞減少了77.9﹪.作轉染了pSG-p53i的胃癌細胞和轉染了:pSG-p53c的胃癌細胞的細胞生長曲線圖,生長曲線圖顯示:與對照細胞相比,轉染了pSG-p53i細胞的生長曲線發(fā)生了一定程度的左移.成功的構建了能