砷劑對(duì)皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞P53功能的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、流行病學(xué)研究表明低濃度砷劑的暴露與皮膚癌等各種腫瘤的發(fā)生有關(guān)。砷劑雖然被公認(rèn)為是人類的致癌劑之一，但是其致癌作用機(jī)制仍存在爭(zhēng)論。有的學(xué)者認(rèn)為砷劑可單獨(dú)引起腫瘤的發(fā)生，而有的學(xué)者認(rèn)為砷劑只是協(xié)同其它致癌物導(dǎo)致正常細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。p53基因是己知的抑癌基因之一，其介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑在細(xì)胞的增殖分化、應(yīng)激和癌變等生命過(guò)程中起著極其重要的作用，被稱為“基因組衛(wèi)士”。鼠雙微粒體2(murine double minute2，MDM2)基因是p53

2、的下游基因之一，p53可激活MDM2轉(zhuǎn)錄，MDM2反過(guò)來(lái)又抑制p53的功能，二者形成自動(dòng)調(diào)節(jié)反饋環(huán)，以保持正常情況下p53處于低水平狀態(tài)。正確的亞細(xì)胞定位對(duì)于p53的功能活性十分重要，p53被激活后進(jìn)入胞核內(nèi)，激活其靶基因的轉(zhuǎn)錄，之后回到胞漿中被降解。MDM2由于具有核輸出序列(NES)和核定位序列(NLS)而具有核漿穿梭能力，NES使MDM2由胞核到胞漿而NLS使之由胞漿到胞核。MDM2蛋白可把p53/MDM2復(fù)合物直接運(yùn)出細(xì)胞核，M

3、DM2的核漿穿梭能力對(duì)其抑制p53的功能活性非常重要。本課題研究中，我們以hTERT永生化的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞為研究對(duì)象，探討了砷劑對(duì)皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞p53功能的影響及MDM2在其中所起的作用機(jī)制，為闡明砷劑引起皮膚癌的機(jī)理提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一章低濃度砷劑經(jīng)由上調(diào)MDM2介導(dǎo)p53胞漿分布所致功能失活 目的：探討低濃度砷劑對(duì)人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞中MDM2蛋白的影響及其與p53的亞細(xì)胞分布狀態(tài)和功能的關(guān)系。 方法：

4、以hTERT永生化的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞為研究對(duì)象。采用蛋白印跡法(Western blotting)研究0.5μmol/L、1μmol/L，和2μmol/L亞砷酸鈉處理12小時(shí)和24小時(shí)后MDM2、p53和絲氨酸15位磷酸化的p53蛋白的表達(dá)水平，并且與5-Fu和紫外線處理作比較。采用細(xì)胞免疫熒光染色法研究砷劑處理前后p53蛋白的亞細(xì)胞定位及細(xì)霉素B和Nutlin-3預(yù)處理對(duì)其影響。 結(jié)果：低濃度砷劑上調(diào)了角質(zhì)形成細(xì)胞中MDM2蛋

5、白的表達(dá)，但對(duì)p53蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響。隨著低濃度砷劑劑量的逐漸增加，MDM2蛋白的表達(dá)水平亦逐漸增加；隨著砷劑作用時(shí)間的逐漸增加，MDM2蛋白的表達(dá)水平也逐漸增強(qiáng)。低濃度砷劑處理后角質(zhì)形成細(xì)胞p53蛋白主要分布在胞漿。細(xì)霉素B和Nutlin-3預(yù)處理可以阻斷砷劑誘導(dǎo)的p53胞漿分布。先用低濃度砷劑處理角質(zhì)形成細(xì)胞后再加5-Fu刺激，此時(shí)5-Fu激活p53功能受到明顯的抑制。 結(jié)論：低濃度砷劑呈劑量和時(shí)間依賴性上調(diào)角質(zhì)形成細(xì)胞中

6、MDM2蛋白的表達(dá)；低濃度砷劑可經(jīng)由上調(diào)MDM2蛋白表達(dá)介導(dǎo)p53的胞漿分布；低濃度砷劑誘導(dǎo)的p53胞漿分布導(dǎo)致p53功能性失活。 第二章低濃度砷劑上調(diào)MDM2的機(jī)制探討 目的：探討低濃度砷劑上調(diào)MDM2表達(dá)的作用機(jī)制。 方法：構(gòu)建pGL3-MDM2基因啟動(dòng)子報(bào)告基因表達(dá)載體，采用熒光素酶報(bào)告基因分析方法觀察亞砷酸鈉對(duì)MDM2基因P1、P2啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響。應(yīng)用1μmol/L和2μmol/L亞砷酸鈉處理皮膚角

7、質(zhì)形成細(xì)胞24h后采用逆轉(zhuǎn)錄.聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測(cè)MDM2 mRNA的表達(dá)水平。應(yīng)用PD98059、SB203580和LY294002等特異性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑預(yù)處理后再觀察砷劑對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞MDM2表達(dá)的影響。 結(jié)果：低濃度砷劑可顯著誘導(dǎo)MDM2基因P1啟動(dòng)子的熒光素酶活性(P<0.05)。隨著低濃度砷劑的劑量逐漸增加，MDM2 mRNA的表達(dá)水平逐漸增高。PD98059預(yù)處理可完全阻斷砷劑上調(diào)角質(zhì)形成細(xì)胞中M

8、DM2的表達(dá)，而SB203580和LY294002預(yù)處理對(duì)砷劑誘導(dǎo)的MDM2表達(dá)上調(diào)無(wú)明顯影響。 結(jié)論：通過(guò)MAPK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，低濃度砷劑激活MDM2基因p1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，從而誘導(dǎo)MDM2的表達(dá)。 第三章低濃度砷劑通過(guò)功能性失活p53發(fā)揮輔助致癌作用 目的：探討低濃度砷劑對(duì)紫外線引起角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡的影響及其與砷性皮膚癌作用機(jī)制的關(guān)系。 方法：應(yīng)用0.5μmol/L和1μmol/L亞砷酸鈉處

9、理角質(zhì)形成細(xì)胞24h后，再用40mJ/cm2紫外線照射。采用流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst33258胞核染色檢測(cè)砷劑和UV引起的細(xì)胞凋亡。 結(jié)果：0.5μmol/L和1μmol/L砷劑處理角質(zhì)形成細(xì)胞后凋亡率分別為1.2％和1.5％，與正常對(duì)照組1.5％無(wú)顯著性差異(P>0.05)。而先經(jīng)過(guò)0.5μmol/L和1μmol/L砷劑預(yù)處理后的角質(zhì)形成細(xì)胞再照射紫外線，此時(shí)凋亡率分別為48.8％和39.9％，與未經(jīng)砷劑預(yù)處理直接照射UV組