食管鱗狀細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移相關(guān)miRNa-612調(diào)控P53的功能和機(jī)制研究.pdf

1、食管鱗狀細(xì)胞癌(Esophageal squamous cell carcinomas，ESCC)作為全球常見的惡性腫瘤之一，具有起病隱匿，高侵襲性生長以及手術(shù)治療后病死率、復(fù)發(fā)率高等臨床特征，大多數(shù)患者在臨床確診時已經(jīng)進(jìn)入中晚期階段。目前治療本病的主要方法是手術(shù)切除加術(shù)后放化療等，其手術(shù)切除率58％～92％。ESCC的高侵襲性和高轉(zhuǎn)移率是預(yù)后差的主要原因，不少患者經(jīng)手術(shù)切除后常發(fā)生轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)，其預(yù)后情況依賴于早期診斷。
　　微小

2、RNA(microRNA，miRNAs)是最近發(fā)現(xiàn)的一類非編碼RNA，在腫瘤的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移等病理生理過程中扮演著非常重要的作用。miRNAs一方面可作為癌基因下調(diào)抑癌基因的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長，另一方面又可作為抑癌基因在轉(zhuǎn)錄后水平與原癌基因結(jié)合，抑制其表達(dá)，從而抑制腫瘤的生長。近來研究表明， miRNAs異常表達(dá)即表達(dá)上調(diào)或下調(diào)可能與人類多種腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移相關(guān)，因此作為目前最受關(guān)注的生物分子之一，成為腫瘤病理學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。近

3、來在腫瘤研究的領(lǐng)域中備受關(guān)注的熱點問題主要包括miRNAs基因表達(dá)譜的篩選，靶基因預(yù)測及相互調(diào)控的功能研究等。
　　在ESCC的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中，miRNAs所扮演的重要角色受到人們越來越多的關(guān)注，對于那些參與了ESCC的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移進(jìn)程的特異性的miRNAs，有可能會成為臨床工作中指導(dǎo)其早期診斷及判斷病程進(jìn)展、預(yù)后的臨床標(biāo)志物。然而在ESCC的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移中，關(guān)于特異性miRNAs所發(fā)揮的作用仍處于探索階段。因此，本

4、研究選用表達(dá)譜基因芯片技術(shù)對ESCC進(jìn)行表達(dá)譜研究，從中篩選出特異性的miRNAs。緊接著我們選擇細(xì)胞株及追加大樣本組織對其進(jìn)行功能及調(diào)控機(jī)制方面的相關(guān)研究。利用生物信息學(xué)分析，篩選出miRNAs可能的靶基因，并在基因水平上驗證靶基因與miRNAs的關(guān)系，從而揭示miRNA s通過調(diào)節(jié)其靶基因促進(jìn)ESCC的浸潤和轉(zhuǎn)移。
　　研究目的:
　　1、應(yīng)用miRNAs表達(dá)譜基因芯片技術(shù)，探討ESCC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組差

5、異性表達(dá)的miRNAs。
　　2、篩選出一種特異性miRNA-612，采用RT-PCR方法檢測組織中特異性表達(dá)的m iRNA-612，從而驗證與基因芯片結(jié)果的一致性。
　　3、利用生物信息學(xué)分析，篩選出miRNA-612特異性靶基因wt-P53。
　　4、選取ESCC細(xì)胞株，通過細(xì)胞劃痕實驗、Transwell小室細(xì)胞遷移實驗及侵襲實驗進(jìn)行miRNA-612的功能驗證。
　　5、Egfp熒光素酶報告載體實驗驗證w

6、t-P53為miRNA-612的特異性靶基因。
　　6、檢測wt-P53在正常粘膜組織及ESCC組織中存在差異表達(dá)。
　　7、從基因和蛋白水平分別驗證miRNA-612和wt-P53在ESCC中存在的靶向關(guān)系。
　　材料和方法:
　　1、選取10例ESCC新鮮凍存組織及對應(yīng)的正常食管粘膜組織，采用上?？党缮镉邢薰敬淼腅xiqon公司的miRNAs表達(dá)譜芯片，Trizol法提取總RNA，采用Axon Gene

7、Pix4000B芯片掃描儀獲取芯片的熒光強(qiáng)度，GenePixpro V6.0軟件獲取數(shù)據(jù)并進(jìn)行原始數(shù)據(jù)分析，t檢驗結(jié)合Fold Change篩選出差異表達(dá)的miRNAs。采用MEV software(v4.6，TIGR)對篩選出的miRNAs進(jìn)行聚類分析，篩選出和ESCC轉(zhuǎn)移相關(guān)的差異表達(dá)的基因。
　　2、選擇基因表達(dá)譜芯片測定中明顯上調(diào)的特異性miRNA-612，以U6作為內(nèi)參基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化，使用RT-PCR方法予以驗證與

8、基因芯片的一致性。
　　3、分別統(tǒng)計TargetScans、Pictar、miRanda和MirTarget2四種生物信息數(shù)據(jù)庫，取四種數(shù)據(jù)庫所預(yù)測的交集作為靶基因，進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology，GO)分析和基因功能分類，結(jié)合既往對ESCC癌基因的研究統(tǒng)計數(shù)據(jù)庫，篩選出miRNA-612可能的靶基因。
　　4、以人ESCC EC109細(xì)胞株進(jìn)行miRNA-612沉默質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染。使用RT-PCR技術(shù)驗證各組的轉(zhuǎn)染

9、效率。隨后對不同組別的細(xì)胞株進(jìn)行功能驗證，包括細(xì)胞劃痕實驗、Transwell小室細(xì)胞遷移實驗及細(xì)胞侵襲實驗。
　　5、將表達(dá)miRNA-612的質(zhì)粒pSilencer/miR-612或者對照質(zhì)粒pSilencer/NC和熒光報告載體pcDNA3-Egfp-P53-3′ UTR或者突變后的熒光報告載體質(zhì)粒pcDNA3-Egfp-P53-3′ UTR mut，采用LipofeCtamine2000共轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48h，

10、使用熒光分光光度儀分別檢測綠色熒光蛋白表達(dá)水平的變化。
　　6、收集2002年4月～2005年2月期間山東大學(xué)附屬千佛山醫(yī)院胸外科ESCC根治手術(shù)病例，分別選取有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的新鮮凍存標(biāo)本34例和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的新鮮凍存標(biāo)本36例，正常鱗狀上皮粘膜組織20例，采用Western blot法分別檢測不同組織中wt-P53的蛋白表達(dá)。
　　7、將表達(dá)miRNA-612的質(zhì)粒pSilencer/miR-612及對照質(zhì)粒pSilenee

11、r/NC分別轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞，分別采用RT-PCR方法及Western blot技術(shù)在mRNA水平及蛋白水平檢測wt-P53的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組ESCC患者相比較，差異表達(dá)的miRNAs共16個，其中表達(dá)上調(diào)的miRNAs有9個，表達(dá)下調(diào)的miRNAs有7個。將這些miRNAs分別進(jìn)行差異倍數(shù)的分析及PAM比較，得到一種與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNAs，即在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中表達(dá)上調(diào)的mi

12、RNA-612。
　　2、經(jīng)RT-PCR驗證，與正常粘膜組織相比，ESCC組織中miRNA-612表達(dá)上調(diào)，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，結(jié)果與基因芯片一致。
　　3、GO數(shù)據(jù)庫及KEGE數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，miRNA-612預(yù)測的靶基因，生物學(xué)功能涉及的環(huán)節(jié)很多，包括細(xì)胞的生長、分化、凋亡以及轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等，從多個方面共同調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。我們選擇可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡與抑制增殖的特異性靶基因wt-P53，blast數(shù)據(jù)庫

13、比對后顯示，wt-P53的3′UTR區(qū)存在能與miRNA-6125′端結(jié)合的相關(guān)序列。
　　4、抑制miRNA-612活性后，在不顯著影響細(xì)胞增殖的前提下，miRNA-612inhibitors能夠顯著降低EC109細(xì)胞的侵襲及遷移能力，提示miRNA-612對人ESCC的發(fā)展和侵襲、轉(zhuǎn)移可能具有正性調(diào)控作用。
　　5、Egfp熒光素酶報告載體實驗中，miR-612可以降低P533′UTR質(zhì)粒中綠色熒光蛋白的表達(dá)，但對于P5

14、33′UTR突變的報告質(zhì)粒表達(dá)的綠色熒光蛋白無明顯影響，提示miRNA-612可以作用于P53的3'UTR區(qū)，即P53是miRNA-612的靶基因。
　　6、Western blot法檢測ESCC組織中wt-P53蛋白的表達(dá)水平，ESCC有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中wt-P53的表達(dá)均明顯低于正常粘膜組織(P＜0.05)，而有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組相比亦存在顯著性差異(P＜0.05)。
　　7、將pSilencer

15、/miRNA-612轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞中，采用RT-PCR及Westernblot法分別檢測wt-P53在mRNAs水平及蛋白水平中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miRNA-612可以下調(diào)wt-P53的mRNAs和蛋白表達(dá)水平，miRNA-612的表達(dá)變化與wt-P53基因的表達(dá)變化呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、經(jīng)基因芯片聯(lián)合生物信息學(xué)技術(shù)分析，篩選出一種與ESCC侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)的特異性mRNAs即miRNA-612。