CHD5基因在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)、功能和調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、前言:喉鱗狀細(xì)胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)是頭頸部常見的惡性腫瘤之一。在我國(guó)特別是東北地區(qū),喉癌的發(fā)病率呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。喉癌發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制的研究將為喉癌預(yù)防和診治提供重要的分子靶標(biāo)。盡管目前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)若干用于評(píng)價(jià)喉癌進(jìn)展的可能生物學(xué)標(biāo)志物,但是它們尚未在臨床工作中得到實(shí)際應(yīng)用。因此對(duì)喉癌進(jìn)行早期診斷,并在基因水平尋求新的診治標(biāo)志物成為當(dāng)前亟需解決的問(wèn)題。
　　 前期,

2、我喉癌課題組的比較基因組雜交研究結(jié)果顯示1p缺失常見于喉鱗狀細(xì)胞癌。1p,特別是1p36是多種惡性腫瘤最常見的缺失部位之一,近30年來(lái),國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究小組試圖在該染色體區(qū)域內(nèi)篩選出一個(gè)或多個(gè)腫瘤抑制基因。2007年,Bagchi等應(yīng)用染色體工程技術(shù)構(gòu)建了1p36增益和缺失小鼠模型,進(jìn)一步研究證實(shí)染色質(zhì)域解旋酶DNA結(jié)合蛋白5(chromodomain helicase DNA-bindingprotein5,chd5)基因位于該染色體區(qū)

3、,具有控制細(xì)胞增殖、凋亡和衰老的功能,提示其可能是一重要候選腫瘤抑制基因。腫瘤抑制基因在疾病的發(fā)生和發(fā)展中扮演非常重要的作用,其序列改變可以造成基因表達(dá)的異常進(jìn)而引起表型的變化,同時(shí),其表達(dá)水平還受表觀遺傳的控制。表觀遺傳調(diào)控機(jī)制包括DNA甲基化、組蛋白修飾和RNA干涉等,而DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)研究最深入、最重要的一種機(jī)制,與許多疾病如腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。在喉癌研究中,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)P16ink4a,ECAD,DAPK,MUM和FH

4、IT等多種腫瘤抑制基因發(fā)生異常甲基化改變并且具有腫瘤特異性,而且,多基因甲基化的腫瘤患者往往預(yù)后較差。最近的研究發(fā)現(xiàn),在多種惡性腫瘤如神經(jīng)母細(xì)胞瘤、胃癌、卵巢癌、直腸癌和乳腺癌組織中,CHD5啟動(dòng)子區(qū)呈現(xiàn)異常甲基化,可以導(dǎo)致該基因表達(dá)沉默。
　　 人類CHD5基因定位于1p36,包含42個(gè)外顯子,編碼的蛋白質(zhì)分子量約為223Kd,屬于CHD蛋白質(zhì)家族的第5個(gè)成員。CHD家族是染色質(zhì)重塑酶SNF2蛋白超級(jí)家族的成員。這類蛋白質(zhì)通過(guò)

5、改變核小體DNA的親和性而影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu),即屏蔽某個(gè)DNA區(qū)域的同時(shí)暴露其他部位,從而參與細(xì)胞的調(diào)節(jié)。然而,CHD5參與腫瘤發(fā)生的機(jī)制仍不十分清楚,迄今未見其與喉癌發(fā)生相關(guān)性的研究報(bào)道。本研究旨在探討CHD5基因在喉癌發(fā)生中的作用及可能的分子機(jī)制。
　　 材料與方法:
　　 以臨床喉癌標(biāo)本和喉癌Hep2細(xì)胞系為實(shí)驗(yàn)材料,應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法、real time-PCR和Western Blot檢測(cè)喉癌組織中CHD5基

6、因的表達(dá)情況。應(yīng)用硫化測(cè)序PCR(Bisulfate Sequencing PCR,BSP)方法檢測(cè)喉癌組織中CHD5基因DNA甲基化情況。統(tǒng)計(jì)分析喉癌患者的臨床資料與CHD5基因表達(dá)和甲基化情況的相互關(guān)系,探討CHD5與喉癌發(fā)生、發(fā)展的相互關(guān)系。利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)可能與CHD5基因上游啟動(dòng)子區(qū)特異序列結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子,并用EMSA和ChIP技術(shù)對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證以評(píng)價(jià)CHD5啟動(dòng)子區(qū)特異甲基化序列與相關(guān)反式作用元件的結(jié)合能力。構(gòu)建C

7、HD5基因表達(dá)載體,將其轉(zhuǎn)染喉癌Hep2細(xì)胞系,通過(guò)realtime PCR和Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后喉癌Hep2細(xì)胞中CHD5基因表達(dá)水平以評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效率,同時(shí),應(yīng)用MTT、流式細(xì)胞術(shù)和Transwell方法分別檢測(cè)CHD5基因過(guò)度表達(dá)對(duì)Hep2細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.免疫組化染色、real time-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,人喉癌組織中CHD5 mRNA和蛋白表

8、達(dá)水平均高于癌旁對(duì)照組織,而在Hep-2細(xì)胞中幾乎未檢測(cè)到CHD5基因的表達(dá);
　　 2.BSP檢測(cè)結(jié)果表明,在人喉癌組織中CHD5基因啟動(dòng)子存在過(guò)度甲基化,且與CHD5基因表達(dá)下調(diào)相關(guān),且Hep-2細(xì)胞中CHD5基因啟動(dòng)子區(qū)DNA表現(xiàn)為完全甲基化;
　　 3.喉癌腫瘤組織中CHD5的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平與喉癌患者的TNM分期有關(guān),與患者的性別、年齡和腫瘤發(fā)生部位無(wú)關(guān);
　　 4.喉癌組織CHD5蛋白質(zhì)表達(dá)水

9、平與CHD5啟動(dòng)子區(qū)過(guò)度甲基化以及患者年齡相關(guān),與患者的性別、腫瘤發(fā)生部位不相關(guān);
　　 5.CHD5啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)結(jié)果表明,經(jīng)Matinspector軟件預(yù)測(cè)發(fā)生異常甲基化的CHD5啟動(dòng)子區(qū)中發(fā)現(xiàn)存在P53、E2F-MYC激活子和RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子ⅡB的結(jié)合位點(diǎn),其中,P53結(jié)合位點(diǎn)的甲基化頻率最高;
　　 6.EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在體外p53可以和去甲基化CHD5序列結(jié)合,而不能與甲基化CHD5序

10、列特異性結(jié)合;
　　 7.ChIP檢測(cè)結(jié)果證明在體內(nèi)p53與去甲基化CHD5序列特異性結(jié)合,DNA過(guò)度甲基化抑制二者的結(jié)合;
　　 8.轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CHD548小時(shí)后,Hep2細(xì)胞的CHD5 mRNA和蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高;
　　 9.與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CHD5組的Hep2細(xì)胞的增殖能力和侵襲力顯著降低、凋亡率顯著升高。
　　 結(jié)論:
　　 1.CHD5基因在喉

11、癌組織組織中表達(dá)下調(diào),并且與患者的腫瘤TNM分期有關(guān),提示其可能參與喉癌的發(fā)生和發(fā)展;
　　 2.CHD5基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化可能是引起喉鱗癌中CHD5表達(dá)下調(diào)的原因之一,且與患者的腫瘤組織中TNM分期和患者年齡有關(guān);
　　 3.p53可以與CHD5基因特異性結(jié)合,其中p53結(jié)合位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)影響二者的結(jié)合能力;
　　 4.CHD5基因具有抑制喉癌細(xì)胞的增殖和侵襲、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的能力,提示其是在喉癌中發(fā)揮腫瘤