白介素21對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞角蛋白17表達(dá)的影響及其分子機(jī)制的研究.pdf

1、銀屑病是一種常見的易反復(fù)發(fā)作的慢性炎癥性皮膚病，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。目前認(rèn)為它是一種由輔助性T細(xì)胞（Th細(xì)胞）為主介導(dǎo)的自身免疫性疾病，多種炎癥細(xì)胞及細(xì)胞因子參與其發(fā)病過程。
　　在銀屑病患者皮損中，角質(zhì)形成細(xì)胞（KC）所表達(dá)的角蛋白譜會(huì)發(fā)生改變，其中包括角蛋白17（K17）水平顯著升高。K17作為“銀屑病增殖相關(guān)角蛋白”在正常皮膚中不表達(dá)或表達(dá)量很低，而在銀屑病患者的皮損中則是高表達(dá)，同時(shí)其表達(dá)水平與銀屑病發(fā)病過程和嚴(yán)重程度有一

2、定相關(guān)性。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)K17與銀屑病的關(guān)系非常密切，在銀屑病發(fā)病過程中可能存在“自身反應(yīng)性T細(xì)胞——細(xì)胞因子——K17”作用環(huán)路，在這個(gè)環(huán)路中K17可以激活自身反應(yīng)性T細(xì)胞，使之分泌一些銀屑病相關(guān)細(xì)胞因子如γ-干擾素（IFN-γ）、白介素17（IL-17）等，從而引發(fā)局部的表皮增生和免疫炎癥反應(yīng)。同時(shí)還可以通過上調(diào)KC中K17的表達(dá)，進(jìn)一步激活自身反應(yīng)性T細(xì)胞，形成一個(gè)相互促進(jìn)的惡性環(huán)路，參與銀屑病的發(fā)生發(fā)展。
　　白介素

3、21（IL-21）主要來源于CD4+T細(xì)胞，因其受體分布廣泛而被視為一種多效性的前炎癥因子，在多種炎癥性和自身免疫性疾病中發(fā)揮作用。IL-21在銀屑病患者皮損中的mRNA和蛋白水平顯著高于健康對(duì)照，且能夠刺激小鼠和銀屑病患者正常表皮的KC進(jìn)行增殖，同時(shí)伴有真皮炎癥細(xì)胞的浸潤，與銀屑病斑塊的病理改變類似，提示IL-21可能在銀屑病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮一定的作用。那么，IL-21與銀屑病嚴(yán)重程度是否相關(guān)？其對(duì)本課題組前期研究的重點(diǎn)——“銀屑病

4、增殖相關(guān)角蛋白”K17的表達(dá)是否有影響及其調(diào)控機(jī)制又如何？本實(shí)驗(yàn)針對(duì)以上問題展開相關(guān)研究。
　　目的：檢測(cè)斑塊型銀屑病患者血清IL-21的表達(dá)水平及其與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性，研究IL-21對(duì)KC表達(dá)K17的影響及其表達(dá)調(diào)控的具體分子機(jī)制。
　　方法：采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)銀屑病患者和健康對(duì)照的血清IL-21水平，用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法比較兩者有無差異，并分析銀屑病患者血清IL-21水平與疾病嚴(yán)重程度評(píng)分（PASI評(píng)分

5、）是否存在相關(guān)性。
　　用不同濃度的IL-21（0ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL）和250U/mL的IFN-γ分別刺激KCs24h和48h提取RNA和蛋白，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real-timePCR）、Westernblot和細(xì)胞免疫熒光染色分別檢測(cè)K17mRNA和蛋白的表達(dá)水平，統(tǒng)計(jì)分析二者之間是否存在劑量依賴關(guān)系，并篩選合適的刺激濃度繼續(xù)后續(xù)分子通路實(shí)驗(yàn)。
　

6、　用篩選出的合適濃度IL-21分別刺激KCs0min、10min、20min、30min，用Westernblot和細(xì)胞免疫熒光染色篩選在KC中出現(xiàn)酪氨酸磷酸化的信號(hào)通路分子。
　　最后為驗(yàn)證前期實(shí)驗(yàn)中所激活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是否與KC中K17的上調(diào)有關(guān)，我們預(yù)先采用相應(yīng)的通路抑制劑處理細(xì)胞2h,再用IL-21刺激KCs，利用Westernblot、Real-timePCR和細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)信號(hào)通路抑制劑能否抑制IL-21誘導(dǎo)的K

7、17表達(dá)。
　　結(jié)果：尋常型銀屑病患者血清IL-21水平高于健康對(duì)照（P＜0.01），且與其PASI評(píng)分呈顯著正相關(guān)（r=0.471，P＜0.01）。采用12.5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mLIL-21分別刺激KCs24h和48h后，均出現(xiàn)不同程度的K17表達(dá)。與空白對(duì)照組相比，12.5ng/mL和25ng/mL組的mRNA及蛋白表達(dá)水平有一定程度的增加，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而50ng/mL和100ng/

8、mL組的mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著高于空白對(duì)照，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），IL-21濃度和K17的表達(dá)量之間存在劑量依賴關(guān)系。采用50ng/mLIL-21分別刺激KCs10min、20min和30min，均可出現(xiàn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）通路的激活。最后采用STAT3特異性通路抑制劑（Piceatannol）和ERK1/2特異性通路抑制劑（PD-98059）預(yù)先處理KCs2h，

9、再用50ng/mLIL-21刺激KCs，K17mRNA和蛋白的表達(dá)均受到抑制。
　　結(jié)論：本研究證明尋常型銀屑病患者血清IL-21水平高于健康對(duì)照，且與PASI評(píng)分呈顯著正相關(guān)，說明IL-21與銀屑病關(guān)系密切，可能參與銀屑病的發(fā)生過程。IL-21能夠上調(diào)K17的表達(dá)，且存在劑量依賴關(guān)系。其具體調(diào)控機(jī)制是通過激活STAT3和ERK1/2來實(shí)現(xiàn)的，說明IL-21在銀屑病中所發(fā)揮的作用可能與K17有關(guān)。IL-21可在角蛋白水平上參與銀屑