杉木、楊樹激光顯微切割體系的建立及RNA質量的控制.pdf

1、激光顯微切割技術(Laser Microdissection，LMD)是在顯微下通過顯微操作系統(tǒng)對欲選取的材料(組織，細胞群，細胞，細胞內組分或染色體區(qū)帶等)進行切割分離并收集用于后續(xù)研究的技術，具有快速、準確且操作簡便的特點。它成功的解決了大塊分離組織中的細胞功能異質性問題，是分子生物學和基因組學一項革命性的技術。近幾年來，激光顯微切割技術逐漸從動物和醫(yī)學研究中拓展到植物研究中來，用于快速準確地將目標細胞或細胞群從植物組織中分離，進行

2、后續(xù)的分子和生化分析。 木材的徑向生長是維管形成層向內分化為次生木質部和向外分化為次生韌皮部的結果。利用分子和細胞學的方法研究木材的形成的基因表達與調控是科學家們近年來努力要解釋的重要科學問題。但由于傳統(tǒng)的方法很難將影響木材形成的關鍵活性組織區(qū)域形成層從或提上加以完整和清晰分離，人們對形成層的認識還相當有限。如何提高取材部位的準確性，是研究形成層區(qū)細胞分化分子機理的關鍵所在。20世紀90年代由于激光顯微切割技術的進展使得這方法的

3、研究變得容易起來。 本研究首先用杉木、楊樹兩種樹種為實驗材料，建立了莖段的冰凍切片技術。通過對杉木、楊樹試管苗實施不同的固定方法和預處理方法，確定了以卡諾固定、蔗糖磷酸緩沖液保護加液氮冷凍的方法制片。冰凍切片的適宜條件為：卡諾固定4-6小時，10％蔗糖磷酸緩沖液保護6-12小時，OCT包埋之后用液氮冷凍50s-90s。切片后脫水處理對切片的質量有一定程度的改善。建立的冰凍切片方法成功應用到田間杉木和楊樹材料中，最薄切片厚度可至1

4、0μm，切片清晰完整，細胞結構易于辨認。本實驗系統(tǒng)地研究了木本植物莖段的切片方法，突破了木本植物冰凍切片易破碎的瓶頸，為激光顯微切割技術在木本植物的細胞分子生物學研究中應用打下扎實的基礎。 用Leica AS LMD激光顯微切割系統(tǒng)切割杉木、楊樹田間材料的冰凍切片，厚度為12μm，10×物鏡下，經過優(yōu)化的激光參數為：Aperture 10～13，Intensity 45～46，Speed 3～5。分別收集了約6000個形成層細胞

5、。用Qiagen RNeasy Micro Kit抽提RNA。由于從顯微切割的組織中提取的為微量RNA，不能用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳均不能檢出。本研究首先用RT-PCR檢驗RNA。用β-Actin引物擴增出了400bp左右的條帶。說明RNA大部分沒有降解。用杉木特異性引物Expansin 2全長引物擴增杉木形成層cDNA，擴增出約1400bp的條帶，說明RNA完整性較好。 從6000個楊樹形成層細胞中提取的RNA，用Ag

6、ilent 2100 Bioanalyzer分析，RNA濃度：1395 pg/μl；rRNA Ratio[28S/18S]：1.3；RNA Integrity Number[RIN]：7.1。RNA完整性較高，基本沒有降解。從毛細管電泳圖中可以看出18S和28S的熒光峰狹長且很高，說明了RNA純度比較高，沒有DNA的污染。經過激光顯微切割的楊樹形成層細胞的RNA的產出率為2.325pg total RNA/cell。該RNA的質量較好，