棗果實總RNA的提取及其反轉錄技術體系的建立.pdf

1、棗(ZiziphusjujubaMill.)是我國特有果樹資源。棗果營養(yǎng)豐富，用途廣泛，深受人們喜愛。棗適應性強，抗旱、耐瘠薄、耐鹽堿，是適于山區(qū)和鹽堿地區(qū)栽種的理想經濟樹種。以無核小棗和金絲小棗不同發(fā)育時期的果實為試材，建立適宜棗果實總RNA提取的方法及其反轉錄的技術體系，為進一步進行棗果實cDNA-AFLP分析及有關的分子生物學操作，闡明棗無核突變體的分子機理，并克隆棗果實無核突變體相關基因，通過基因工程培育優(yōu)良的無核棗品種奠定基礎

2、。研究主要內容如下：1.試驗在參照大量總RNA提取方法的基礎上，設計了棗果實總RNA的提取方法，即改良SDS法。通過比較改良CTAB法和本試驗設計的SDS法對棗果實總RNA的提取結果，發(fā)現本研究設計的SDS法提取總RNA的質量更高，效果更好。進一步通過對設計的SDS法優(yōu)化，即重點研究了最佳試材的用量、無水乙醇和異丙醇沉淀RNA效果的比較、LiCl去除多糖的效果以及LiCl和無水乙醇沉淀RNA先后順序不同對RNA的影響等方面，確定了棗果實

3、總RNA提取最佳技術體系，該體系提取的棗果實總RNA無降解、無污染，OD260/OD280為1.8-2.0；OD280/OD230大于2.0。利用該體系提取了金絲小棗和無核小棗不同時期的果實總RNA。 2.棗果實不同發(fā)育階段RNA含量不同，發(fā)育早期階段RNA含量高。 3.研究了無水乙醇、異丙醇沉淀RNA的效果，確定了最佳沉淀RNA的方法，即2.5倍體積的無水乙醇效果最好。 4.建立了適合棗果實總RNA的純化技術體

4、系，確定了合適的DNase的用量，即40μL體系中，DNase的用量為10U。 5.建立了棗果實反轉錄合成cDNA技術體系。其中，反轉錄cDNA第一條鏈體系為：10μL體系中，含有5μL純化后的RNA，1.625μLOligo(dT)15，0.125μLRNA酶抑制劑(40U/μL)，1μL10mmol/μLdNTPs，2μL5倍RTase-AMV緩沖液，0.25μLRTase-AMV(10U/μL)；合成第二條鏈cDNA體系為