羊梨形蟲核糖體RNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列的測定及反向線狀印跡技術(shù)的建立.pdf

1、羊梨形蟲病(舊稱羊焦蟲病)是由頂復(fù)門、梨形蟲綱、梨形蟲目中的巴貝斯科(Babesiidae)巴貝斯屬(Babesia)和泰勒科(Theileriidae)泰勒屬(Theileria)的多種原蟲寄生于羊的紅細(xì)胞或網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)所引起的一類血液原蟲病的統(tǒng)稱，臨床以高熱、貧血、黃疸、血紅蛋白尿或體表淋巴結(jié)腫大為主要特征，嚴(yán)重對(duì)可引起動(dòng)物死亡。本病在我國分布廣、危害嚴(yán)重，常常給疫區(qū)的養(yǎng)羊業(yè)造成巨大損失。 本研究利用實(shí)驗(yàn)室液氮保存的羊梨形

2、蟲病病原，包括2種(6株)羊的巴貝斯蟲和2種(2株)羊的泰勒蟲，采用核糖體RNA的兩個(gè)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS1和ITS2)基因組區(qū)域和5.8S rRNA基因序列分析方法，對(duì)我國的新疆喀什地區(qū)、河北承德以及甘肅省的臨潭、寧縣、天祝、麻當(dāng)六個(gè)不同地區(qū)羊的巴貝斯蟲和甘肅省的渭源、寧夏的隆德兩個(gè)地區(qū)羊泰勒蟲進(jìn)行分子分類學(xué)及分子診斷研究。其主要研究結(jié)果包括兩個(gè)方面： 1。利用實(shí)驗(yàn)室保存的8株羊梨形蟲，提取基因組DNA，測得ITS1-5.8S

3、-ITS2、ITS1、5.8S和ITS2序列，分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，并進(jìn)行同源性比較。結(jié)果顯示我國羊的梨形蟲可明顯分為巴貝斯蟲和泰勒蟲兩枝；其中，莫氏巴貝斯蟲株之間的同源性明顯高于新疆喀什株未定種巴貝斯蟲。巴貝斯蟲的ITSl和rrS2核苷酸區(qū)段變異較大，種間同源性分別在19.7％-99.4％，河北株、寧縣株、臨潭株、天祝株和麻當(dāng)株的巴貝斯蟲都是由血蜱屬傳播的，在遺傳演化過程中的親緣關(guān)系較近，同源性比較高，在ITS1-5.85-ITS2、I

4、TS1和ITS2序列的系統(tǒng)發(fā)生樹上，共處一枝。新疆喀什株是由璃眼蜱屬傳播的，被其它的一些巴貝斯蟲隔開，獨(dú)立占有一枝，可以認(rèn)為是一個(gè)獨(dú)立的種。5.8S rRNA較保守，種間同源性在87.1％-100％之間，系統(tǒng)發(fā)生樹上各種巴貝斯蟲的分布與ITS1-5.8S-ITS2、ITS1和ITS2系統(tǒng)發(fā)生樹基本一致。兩種泰勒蟲之間的同源性比較高，同已經(jīng)測得的18S rRNA基因區(qū)段相似，其ITS1和ITS2區(qū)段種間變異較小，ITS1-5.8S-ITS

5、2、ITS1、5.8S和ITS2序列的同源性分別為96.8％、96.4％、100％和95.2％。該結(jié)果與18s rRNA基因序列分類方法基本符合。 2。在已經(jīng)確定的18S rRNA基因V4高變區(qū)段的基礎(chǔ)上，利用反向線狀印跡雜交技術(shù)(RLB)高特異性和高敏感性的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了梨形蟲通用探針和屬種特異性探針，用RLB技術(shù)檢測以上8株羊梨形蟲。所有種特異性探針都僅僅和它們各自的靶序列發(fā)生反應(yīng)，無論是在不同蟲種，還是不同種群之間都沒有交叉

6、反應(yīng)，與綿羊/山羊基因組對(duì)照試驗(yàn)沒有雜交信號(hào)。將兩種羊巴貝斯蟲(莫氏巴貝斯蟲和巴貝斯蟲未定種喀什株)和兩種羊泰勒蟲(呂氏泰勒蟲渭源株，尤氏泰勒蟲隆德株)基因組經(jīng)分光光度計(jì)定量在100ng/ul，連續(xù)10倍稀釋10-1-10-12，用RLB方法檢測，結(jié)果顯示泰勒蟲較羊巴貝斯蟲的敏感性高，莫氏巴貝斯蟲、巴貝斯蟲未定種喀什株、呂氏泰勒蟲和尤氏巴貝斯蟲的敏感性分別是0.01pg、0.1ng、0.0001pg、0.1pg，呂氏泰勒蟲的敏感性明顯高