高良姜與大高良姜的rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列分析.pdf

1、目的：通過(guò)對(duì)不同來(lái)源高良姜與大高良姜的rDNAITS區(qū)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序、分析，為中藥高良姜的種屬鑒定提供可靠的分子標(biāo)記。方法：（1）以改良的CTAB法提取高良姜與混淆品大高良姜的基因組DNA。（2）以通用引物對(duì)高良姜與混淆品大高良姜的rDNAITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行堿基序列測(cè)定。（3）運(yùn)用ClustalX、MEGA2.0等多種序列分析軟件對(duì)測(cè)序所得堿基序列進(jìn)行對(duì)位排列，并進(jìn)行聚類(lèi)分析；測(cè)序結(jié)果申請(qǐng)登錄于GenBa

2、nk中。結(jié)果：（1）改良CTAB法提取的高良姜與混淆品大高良姜的基因組DNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，OD260/OD280比值為1.8～2.0，符合PCR模板的要求。（2）經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得ITS，通過(guò)與Genbank中已經(jīng)登錄的高良姜與大高良姜的ITS對(duì)照，比較徐聞良姜與其它地方高良姜以及大高良姜的ITS序列差異，為廣東道地藥材徐聞良姜提供分子鑒別依據(jù)。經(jīng)blast軟件序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)高良姜與大高良姜的ITS區(qū)長(zhǎng)度范圍在568～576bp

3、間，高良姜的ITS1與ITS2序列長(zhǎng)度分別為117bp、227bp，大高良姜的ITS1與ITS2序列長(zhǎng)度分別為178bp、234bp，5.8s區(qū)均為164個(gè)堿基；約有32處變異位點(diǎn)，主要集中在ITS1區(qū)和ITS2區(qū)，且多為A-G間發(fā)生顛換。ITS1單個(gè)堿基變異位點(diǎn)較多，而ITS2區(qū)有兩處較大片段的缺失，且表現(xiàn)較為一致的種間差異性，5.8s區(qū)僅存一處變異位點(diǎn)。（3）將所得的高良姜與混淆品大高良姜的rDNAITS序列經(jīng)對(duì)比分析后，提交于Ge

4、nBank中。獲得的登錄編號(hào)分別為GU097441（廣東徐聞高良姜）、GU097439（廣西南寧高良姜）、GU097442（廣東高州高良姜）、GU097440（福建南靖大高良姜）、GU097443（海南萬(wàn)寧大高良姜）。（4）經(jīng)序列分析軟件作出系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；聚類(lèi)分析表明不同居群的高良姜聚為1類(lèi)，混淆品大高良姜聚為1類(lèi)。結(jié)論：（1）獲得廣東徐聞等地的高良姜與大高良姜的rDNAITS序列，并提交于Genbank核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)。（2）rDNAITS