梨火疫病原菌核糖體基因結(jié)構(gòu)序列的特征研究及病菌的分子檢測.pdf

1、梨火疫病菌(Erwinia amylovory)引起的梨火疫病是梨樹、蘋果樹等薔薇科植物上是最具毀滅性的病害之一，是我國重要的進境檢疫對象。梨火疫病菌的長距離傳播主要靠不同地區(qū)間繁殖材料和水果的調(diào)運完成。因此，完善梨火疫病菌的檢測體系有助于控制梨火疫病在我國的傳播。 本研究利用細菌通用引物16SF/16SR擴增出梨火疫病菌16s的1489bp核糖體基因片段，根據(jù)16S序列比對，與GenBank中登記序號為AF141895.1的梨

2、火疫病菌16S序列有98％的相似性，即證明菌株的正確性。 利用細菌通用引物C1/C3擴增23S序列，其長度為2446bp。在23S、16s片段中設(shè)計引物23SL/16SL，ITS-S/ITS-R分別擴增16S與23S間和ITS1序列，擴增片段大小分別為1657bp、397bp，經(jīng)軟件編輯，梨火疫病菌核糖體基因全長為5813 bp。其中ITS1為397bp，23S為2917bp，lTS2序列為88bp，5S為115bp，IGS為8

3、07bp，其中ITS1序列中含有一個tRNA-Glu。 利用DNAMan、DNAsist1.0、Primer5.0軟件，對23S、IGS堿基序列的酶切位點、ORF、motif結(jié)構(gòu)進行初步分析。利用軟件包EXPAsY將23S、IGS堿基序列推導(dǎo)為氨基酸序列后，對等電點、跨膜螺旋、疏水性等進行計算、預(yù)測；預(yù)測這些氨基酸序列二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示梨火疫病菌的23S、IGS氨基酸二級結(jié)構(gòu)均有α螺旋，β折疊：據(jù)PDB數(shù)據(jù)庫的氨基酸二級結(jié)構(gòu)比對

4、結(jié)果表明，23S與編號為2EZU65的氨基酸相似性為33％，IGS與編號為2GMW66的氨基酸相似性為75％。 據(jù)23S、IGS序列設(shè)計的特異引物23SF/23SR、IGS-S/IGS-R，分別在梨火疫病菌中擴增出166bp和1 54bp特異片段，檢測的靈敏度分別為10-6μg/mL和10-7μg/mL，量化為細菌個數(shù)，23SF/23SR檢測靈敏度為3.4x102cfu/ml。 根據(jù)梨火疫病在中國的潛在預(yù)測分布，采集可能